趙海忠 李良華 宋忠旭 孫華 彭先文 梅書(shū)棋
摘要:針對(duì)最常用的兩種動(dòng)物抗病毒藥物金剛烷胺和利巴韋林,闡述了其抗病毒作用機(jī)理及在動(dòng)物體內(nèi)的殘留,歸納總結(jié)了藥物殘留儀器分析法和生物分析法檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展,結(jié)合抗病毒藥物殘留檢測(cè)重要性和實(shí)踐應(yīng)用前景提出應(yīng)發(fā)展ELISA檢測(cè)方法。
關(guān)鍵詞:抗病毒藥;殘留檢測(cè);動(dòng)物組織
中圖分類(lèi)號(hào):S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1007-273X(2019)03-0014-03
隨著畜禽集約化飼養(yǎng)程度提高,動(dòng)物感染病毒致死的比率高達(dá)36.8%[1],人用抗病毒藥物由于價(jià)格低、療效好曾被報(bào)道廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[2-4],尤其金剛烷胺類(lèi)和利巴韋林應(yīng)用最多、效果最顯著。病毒能夠通過(guò)基因的交換與重組對(duì)藥物產(chǎn)生抗性,病毒耐藥性的產(chǎn)生對(duì)人形成潛在威脅,并嚴(yán)重影響藥物對(duì)人的治療作用[5,6]。因此,我國(guó)農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告明令禁止動(dòng)物使用金剛烷胺、金剛乙胺、嗎啉(雙)胍(病毒靈)、利巴韋林等抗病毒藥物,2005年還發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》,要求禁止生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用金剛烷胺等抗病毒藥物防治高致病性禽流感等一類(lèi)病原微生物引起的病毒性疫病。美國(guó)食品藥物管理局2006年即禁止在雞、鴨等動(dòng)物中使用金剛烷胺等抗流感病毒的藥物。但生產(chǎn)中違規(guī)濫用仍存在,必須加強(qiáng)藥物殘留檢測(cè)。動(dòng)物源性食品中抗病毒藥物殘留的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和生物分析法。本文通過(guò)對(duì)金剛烷胺和利巴韋林兩種抗病毒藥物抗病毒作用機(jī)理的詮釋以及在動(dòng)物體內(nèi)殘留特性,介紹了藥物殘留檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展,旨在改進(jìn)和研發(fā)靈敏性、便利性的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物源食品中抗病毒藥物的殘留,切實(shí)保障人類(lèi)食品安全水平不斷提高。
1 抗病毒藥物的分類(lèi)和機(jī)理
抗病毒藥物不破壞病毒體,也不損傷宿主細(xì)胞,主要作用在于抑制病毒的增殖,輔助宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒侵襲,修復(fù)被破壞的組織,緩和病情使之不出現(xiàn)臨床癥狀。常見(jiàn)的抗病毒藥物主要分為四類(lèi)[2]。金剛烷胺類(lèi)藥物抑制病毒復(fù)制初期,主要通過(guò)阻斷病毒基因的脫殼,使病毒核酸不能進(jìn)入宿主細(xì)胞,抑制病毒復(fù)制,保護(hù)宿主抵御病毒侵襲。神經(jīng)氨酸酶抑制劑類(lèi)藥物主要通過(guò)抑制神經(jīng)氨酸酶的活性,阻止子代病毒顆粒在宿主細(xì)胞的復(fù)制和釋放,減少病毒的持續(xù)時(shí)間,如奧司他韋。核苷類(lèi)藥物在病毒復(fù)制過(guò)程中,藥物競(jìng)爭(zhēng)性地與病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相結(jié)合,從而抑制酶活性,干擾病毒核酸的合成,產(chǎn)生抗病毒作用,如利巴韋林。廣譜抗病毒類(lèi)藥物對(duì)多種病毒增殖期的各個(gè)環(huán)節(jié)都有作用,如嗎啉胍等。畜禽養(yǎng)殖中使用最廣泛、效果最顯著、最具代表性的抗病毒藥物為金剛烷胺和利巴韋林。
2 抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留
抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)多以原型存在,但含量高低不同。不同的抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物存在差異[7]。金剛烷胺在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生降解代謝的量極少,90%以原型經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)隨尿排出,部分可被再吸收。利巴韋林在動(dòng)物體內(nèi)以原型的代謝形式占多數(shù)[8]。在獸藥殘留檢測(cè)中主要針對(duì)的是可食性組織如肌肉、肝臟等。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中檢出原型即能滿(mǎn)足監(jiān)管要求,可不采用酶解,以簡(jiǎn)化步驟,提高監(jiān)測(cè)效率。
3 抗病毒藥物殘留檢測(cè)的儀器分析法
3.1 氣相色譜法(GC)
氣相色譜法是以氣體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程,具有分離效率高、分析速度快、選擇性較好、樣品用量少、檢測(cè)靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)60年代氣相色譜法廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析,大大提高了獸藥殘留量的檢測(cè)精度。目前,該法已成為最典型、應(yīng)用最廣的分析方法。Yao等[9]檢測(cè)金剛烷胺檢出限達(dá)2 ng/mL。
3.2 高效液相色譜法(HPLC)
高效液相色譜法(HPLC)是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段,幾乎所有的化合物和大分子物質(zhì)均可用HPLC進(jìn)行測(cè)定。該方法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制,其分離機(jī)制與常規(guī)色譜柱相同,但填料更加精細(xì)(0.5~10.0 μm),在殘留檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用,但存在溶劑消耗量大、色譜柱價(jià)格較貴、污染環(huán)境等不足。
3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)
80%以上的抗病毒藥物殘留檢測(cè)方法均是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,其具有分離效果好、靈敏度高、檢出限低、回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。Berendsen等[10]檢測(cè)金剛烷胺、利巴韋林等,其定量限為1~10 μg/kg。
3.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)
高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)在LC-MS/MS基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。云環(huán)等[11]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)肌肉組織中的金剛烷胺和利巴韋林,檢測(cè)限為4.0 μg/kg,并在1.0~50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,回收率75.9%~108.5%。王維霞[12]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)雞肉組織中利巴韋林殘留量,檢出限為2.0 ng/g且在1.0~50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,操作簡(jiǎn)便快捷且準(zhǔn)確度高。Higashi等[13]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)大鼠血漿中金剛烷胺等抗病毒藥物,檢測(cè)限為0.025 ng/mL,回收率高于95%。
3.5 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)
Liu等[14]建立了LC-ESI-MS/MS檢測(cè)雞肉組織中金剛烷胺等殘留量,最低檢出限為0.06~0.30 μg/kg,雞肝中為0.2~1.0 μg/kg,雞肉中平均回收率為72.3%~94.2%,雞肝中為70.8%~92.7%,靈敏度高,準(zhǔn)確性好。
國(guó)內(nèi)儀器方法上建立了金剛烷胺等抗病毒藥物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并用于定性、定量的檢測(cè)實(shí)施。儀器方法具有高精密度和準(zhǔn)確度,且能同時(shí)進(jìn)行多殘分析,但儀器昂貴,樣品前處理繁瑣,需要專(zhuān)業(yè)人員操作,更適用于科研機(jī)構(gòu)和國(guó)家權(quán)威部門(mén)對(duì)藥物的確認(rèn)檢測(cè)。
抗病毒藥物儀器檢測(cè)法研究進(jìn)展見(jiàn)表1。從表1中可以看出,方法的檢出限在0.06~25.00 μg/kg,能較好地滿(mǎn)足抗病毒藥物殘留檢測(cè)分析方法的要求。
4 抗病毒藥物殘留檢測(cè)的生物分析法
生物分析法包括免疫法、受體法等。孫海新[5]通過(guò)分子生物學(xué)方法建立了金剛烷胺受體蛋白表達(dá)系統(tǒng),以評(píng)價(jià)受體蛋白的親和活性提出其作為金剛烷胺生物識(shí)別材料的潛力。通過(guò)優(yōu)化親和檢測(cè)體系參數(shù),最后達(dá)到IC50為459 ng/mL,與金剛乙胺的交叉反應(yīng)率為72%。檢測(cè)回收率在74%~104%,批內(nèi)變異系數(shù)為5.0%~19.0%,批間變異系數(shù)為6.5%~15.5%。這種通過(guò)親和力受體識(shí)別藥物的想法創(chuàng)新但各方面技術(shù)尚不成熟,對(duì)藥物識(shí)別的靈敏度不高。
免疫分析法根據(jù)待測(cè)藥物的共性結(jié)構(gòu)或共有結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)并合成突出其結(jié)構(gòu)特征的半抗原,半抗原與大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)后作為全抗原并免疫動(dòng)物,通過(guò)細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞,收集并純化雜交瘤細(xì)胞分泌的類(lèi)特異性抗體,利用抗體建立免疫分析法。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)具有成本低、易操作、高效率、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn),適用于大批量樣品的篩選。目前ELISA方法廣泛應(yīng)用于氨基糖苷類(lèi)抗生素[25]等獸藥殘留檢測(cè),但對(duì)金剛烷胺類(lèi)和利巴韋林殘留檢測(cè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,研究并制備抗病毒藥物的有效ELISA檢測(cè)方法十分有必要。
5 結(jié)語(yǔ)
縱觀(guān)金剛烷胺和利巴韋林殘留檢測(cè)的實(shí)踐與發(fā)展,盡管儀器監(jiān)測(cè)是最主要的方法,但不適用于高通量篩選,發(fā)展起來(lái)的ELISA方法因其簡(jiǎn)單、方便、靈敏度高、特異性好,順理成章成為當(dāng)前世界推行的高通量篩選方法。在養(yǎng)殖實(shí)踐中,受儀器與專(zhuān)業(yè)人員的局限,如研制出抗病毒藥物ELISA檢測(cè)試劑盒,能夠快速、準(zhǔn)確進(jìn)行殘留檢測(cè),將發(fā)揮重要的作用,并具有廣闊應(yīng)用前景。
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