動(dòng)物抗病毒藥殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

趙海忠 李良華 宋忠旭 孫華 彭先文 梅書(shū)棋

摘要：針對(duì)最常用的兩種動(dòng)物抗病毒藥物金剛烷胺和利巴韋林，闡述了其抗病毒作用機(jī)理及在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，歸納總結(jié)了藥物殘留儀器分析法和生物分析法檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展，結(jié)合抗病毒藥物殘留檢測(cè)重要性和實(shí)踐應(yīng)用前景提出應(yīng)發(fā)展ELISA檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：抗病毒藥；殘留檢測(cè)；動(dòng)物組織

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2019）03-0014-03

隨著畜禽集約化飼養(yǎng)程度提高，動(dòng)物感染病毒致死的比率高達(dá)36.8%[1]，人用抗病毒藥物由于價(jià)格低、療效好曾被報(bào)道廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[2-4]，尤其金剛烷胺類(lèi)和利巴韋林應(yīng)用最多、效果最顯著。病毒能夠通過(guò)基因的交換與重組對(duì)藥物產(chǎn)生抗性，病毒耐藥性的產(chǎn)生對(duì)人形成潛在威脅，并嚴(yán)重影響藥物對(duì)人的治療作用[5，6]。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告明令禁止動(dòng)物使用金剛烷胺、金剛乙胺、嗎啉（雙）胍（病毒靈）、利巴韋林等抗病毒藥物，2005年還發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，要求禁止生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用金剛烷胺等抗病毒藥物防治高致病性禽流感等一類(lèi)病原微生物引起的病毒性疫病。美國(guó)食品藥物管理局2006年即禁止在雞、鴨等動(dòng)物中使用金剛烷胺等抗流感病毒的藥物。但生產(chǎn)中違規(guī)濫用仍存在，必須加強(qiáng)藥物殘留檢測(cè)。動(dòng)物源性食品中抗病毒藥物殘留的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和生物分析法。本文通過(guò)對(duì)金剛烷胺和利巴韋林兩種抗病毒藥物抗病毒作用機(jī)理的詮釋以及在動(dòng)物體內(nèi)殘留特性，介紹了藥物殘留檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展，旨在改進(jìn)和研發(fā)靈敏性、便利性的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物源食品中抗病毒藥物的殘留，切實(shí)保障人類(lèi)食品安全水平不斷提高。

1 抗病毒藥物的分類(lèi)和機(jī)理

抗病毒藥物不破壞病毒體，也不損傷宿主細(xì)胞，主要作用在于抑制病毒的增殖，輔助宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒侵襲，修復(fù)被破壞的組織，緩和病情使之不出現(xiàn)臨床癥狀。常見(jiàn)的抗病毒藥物主要分為四類(lèi)[2]。金剛烷胺類(lèi)藥物抑制病毒復(fù)制初期，主要通過(guò)阻斷病毒基因的脫殼，使病毒核酸不能進(jìn)入宿主細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制，保護(hù)宿主抵御病毒侵襲。神經(jīng)氨酸酶抑制劑類(lèi)藥物主要通過(guò)抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，阻止子代病毒顆粒在宿主細(xì)胞的復(fù)制和釋放，減少病毒的持續(xù)時(shí)間，如奧司他韋。核苷類(lèi)藥物在病毒復(fù)制過(guò)程中，藥物競(jìng)爭(zhēng)性地與病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相結(jié)合，從而抑制酶活性，干擾病毒核酸的合成，產(chǎn)生抗病毒作用，如利巴韋林。廣譜抗病毒類(lèi)藥物對(duì)多種病毒增殖期的各個(gè)環(huán)節(jié)都有作用，如嗎啉胍等。畜禽養(yǎng)殖中使用最廣泛、效果最顯著、最具代表性的抗病毒藥物為金剛烷胺和利巴韋林。

2 抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留

抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)多以原型存在，但含量高低不同。不同的抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物存在差異[7]。金剛烷胺在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生降解代謝的量極少，90%以原型經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)隨尿排出，部分可被再吸收。利巴韋林在動(dòng)物體內(nèi)以原型的代謝形式占多數(shù)[8]。在獸藥殘留檢測(cè)中主要針對(duì)的是可食性組織如肌肉、肝臟等。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中檢出原型即能滿(mǎn)足監(jiān)管要求，可不采用酶解，以簡(jiǎn)化步驟，提高監(jiān)測(cè)效率。

3 抗病毒藥物殘留檢測(cè)的儀器分析法

3.1 氣相色譜法（GC）

氣相色譜法是以氣體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程，具有分離效率高、分析速度快、選擇性較好、樣品用量少、檢測(cè)靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)60年代氣相色譜法廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析，大大提高了獸藥殘留量的檢測(cè)精度。目前，該法已成為最典型、應(yīng)用最廣的分析方法。Yao等[9]檢測(cè)金剛烷胺檢出限達(dá)2 ng/mL。

3.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段，幾乎所有的化合物和大分子物質(zhì)均可用HPLC進(jìn)行測(cè)定。該方法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，其分離機(jī)制與常規(guī)色譜柱相同，但填料更加精細(xì)（0.5～10.0 μm），在殘留檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用，但存在溶劑消耗量大、色譜柱價(jià)格較貴、污染環(huán)境等不足。

3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）

80%以上的抗病毒藥物殘留檢測(cè)方法均是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其具有分離效果好、靈敏度高、檢出限低、回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。Berendsen等[10]檢測(cè)金剛烷胺、利巴韋林等，其定量限為1～10 μg/kg。

3.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）在LC-MS/MS基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。云環(huán)等[11]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)肌肉組織中的金剛烷胺和利巴韋林，檢測(cè)限為4.0 μg/kg，并在1.0～50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回收率75.9%～108.5%。王維霞[12]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)雞肉組織中利巴韋林殘留量，檢出限為2.0 ng/g且在1.0～50.0 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，操作簡(jiǎn)便快捷且準(zhǔn)確度高。Higashi等[13]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)大鼠血漿中金剛烷胺等抗病毒藥物，檢測(cè)限為0.025 ng/mL，回收率高于95%。

3.5 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ESI-MS/MS）

Liu等[14]建立了LC-ESI-MS/MS檢測(cè)雞肉組織中金剛烷胺等殘留量，最低檢出限為0.06～0.30 μg/kg，雞肝中為0.2～1.0 μg/kg，雞肉中平均回收率為72.3%～94.2%，雞肝中為70.8%～92.7%，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。

國(guó)內(nèi)儀器方法上建立了金剛烷胺等抗病毒藥物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并用于定性、定量的檢測(cè)實(shí)施。儀器方法具有高精密度和準(zhǔn)確度，且能同時(shí)進(jìn)行多殘分析，但儀器昂貴，樣品前處理繁瑣，需要專(zhuān)業(yè)人員操作，更適用于科研機(jī)構(gòu)和國(guó)家權(quán)威部門(mén)對(duì)藥物的確認(rèn)檢測(cè)。

抗病毒藥物儀器檢測(cè)法研究進(jìn)展見(jiàn)表1。從表1中可以看出，方法的檢出限在0.06～25.00 μg/kg，能較好地滿(mǎn)足抗病毒藥物殘留檢測(cè)分析方法的要求。

4 抗病毒藥物殘留檢測(cè)的生物分析法

生物分析法包括免疫法、受體法等。孫海新[5]通過(guò)分子生物學(xué)方法建立了金剛烷胺受體蛋白表達(dá)系統(tǒng)，以評(píng)價(jià)受體蛋白的親和活性提出其作為金剛烷胺生物識(shí)別材料的潛力。通過(guò)優(yōu)化親和檢測(cè)體系參數(shù)，最后達(dá)到IC50為459 ng/mL，與金剛乙胺的交叉反應(yīng)率為72%。檢測(cè)回收率在74%～104%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.0%～19.0%，批間變異系數(shù)為6.5%～15.5%。這種通過(guò)親和力受體識(shí)別藥物的想法創(chuàng)新但各方面技術(shù)尚不成熟，對(duì)藥物識(shí)別的靈敏度不高。

免疫分析法根據(jù)待測(cè)藥物的共性結(jié)構(gòu)或共有結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)并合成突出其結(jié)構(gòu)特征的半抗原，半抗原與大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)后作為全抗原并免疫動(dòng)物，通過(guò)細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，收集并純化雜交瘤細(xì)胞分泌的類(lèi)特異性抗體，利用抗體建立免疫分析法。酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）具有成本低、易操作、高效率、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量樣品的篩選。目前ELISA方法廣泛應(yīng)用于氨基糖苷類(lèi)抗生素[25]等獸藥殘留檢測(cè)，但對(duì)金剛烷胺類(lèi)和利巴韋林殘留檢測(cè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，研究并制備抗病毒藥物的有效ELISA檢測(cè)方法十分有必要。

5 結(jié)語(yǔ)

縱觀(guān)金剛烷胺和利巴韋林殘留檢測(cè)的實(shí)踐與發(fā)展，盡管儀器監(jiān)測(cè)是最主要的方法，但不適用于高通量篩選，發(fā)展起來(lái)的ELISA方法因其簡(jiǎn)單、方便、靈敏度高、特異性好，順理成章成為當(dāng)前世界推行的高通量篩選方法。在養(yǎng)殖實(shí)踐中，受儀器與專(zhuān)業(yè)人員的局限，如研制出抗病毒藥物ELISA檢測(cè)試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確進(jìn)行殘留檢測(cè)，將發(fā)揮重要的作用，并具有廣闊應(yīng)用前景。

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