三種茶堿緩釋片含量測(cè)定方法比較

楊國(guó)寧 劉延娟 仝桂平 趙蕊蕊 畢天琛

茶堿類(lèi)藥物具有擴(kuò)張支氣管、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制血小板活性[1]等作用，是治療哮喘的常用藥物。為確保血藥濃度處于穩(wěn)定狀態(tài)，縮減血藥濃度波動(dòng)引起的異常，避免不良反應(yīng)產(chǎn)生，緩釋劑為其常見(jiàn)劑型。

測(cè)定茶堿的方法包括容量分析法、紫外分光光度法（UV）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3-4]等。茶堿緩釋片因療效確切、質(zhì)量易控一直收載于《中華人民共和國(guó)藥典》[5]中，現(xiàn)行藥典[6]采用容量分析 法測(cè)定茶堿緩釋片的含量。筆者在工作中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的容量分析方法存在一定不足，本研究就3 種茶堿緩釋片含量測(cè)定方法的可行性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

XS-105 電子分析天平（梅特勒-托利多）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；pHS-3C 型pH 計(jì)（上海大普）；恒溫水浴振蕩器（常州菲普）。

1.2 試劑與試藥

茶堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)：100121-201104；含量：100.0%）；可可堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)：100110-201202；含量：100.0%）；茶堿緩釋片4 批（批號(hào)：20180703、20180707、20180911、20180919，規(guī)格：0.1 g/片）；醋酸鈉，醋酸銨，冰醋酸（分析純）；甲醇、乙腈（色譜純），超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 方法1色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為醋酸鹽緩沖液（取醋酸鈉1.36 g，加水100 ml 溶解，加冰醋酸5 ml，再加水稀釋至1000 ml）∶乙腈（93∶7）；檢測(cè)波長(zhǎng)：271 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μl[6]。

2.1.2 方法2除流動(dòng)相為醋酸鹽緩沖液（取醋酸銨0.771 g，加水800 ml 溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至5.5，再加水稀釋至1000 ml）∶甲醇（75∶25）[7]外，其他色譜條件同方法1。

2.2 溶液制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液制備精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品與可可堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成10 μg/ml溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成100 μg/ml 溶液。

2.2.3 供試品溶液制備取本品20 片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于無(wú)水茶堿0.1 g），置量瓶中，加流動(dòng)相適量，70℃水浴震蕩20 min[5]，加流動(dòng)相稀釋制成100 μg/ml 溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性取2.2.1項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液20 μl，在2.1.1 和2.1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣，按茶堿峰計(jì)，理論板數(shù)分別為9568、7800?？煽蓧A與茶堿的分離度分別為10.5、8.8。理論塔板數(shù)均大于5000，分離度均大于2.0[6]。

2.3.2 精密度分別取對(duì)照品溶液20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6 針，方法1 茶堿平均峰面積為7802.14，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.12%；方法2 平均峰面積為7749.03，RSD 為0.05%。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3.3 線性關(guān)系考察精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成1000 μg/ml 溶液，分別量取上述溶液0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、5.0 ml 置10 ml 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，分別進(jìn)樣20 μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果茶堿分別在5.34～534 μg/ml、5.12～512 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為y=64.074x+3.0107（r= 0.9999）、y=65.799x+55.240（r=0.9997）。

2.3.4 檢出限與定量限考察取2.3.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)婪y(cè)定，S/N≈10 時(shí)測(cè)得定量限分別為0.13 μg/ml、0.10 μg/ml。S/N≈3 時(shí)測(cè)得檢出限分別為0.045 μg/ml、0.026 μg/ml。

2.3.5 回收率考察精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解成 500 μg/ml 溶液；精密稱(chēng)取樣品（20180703）6 份，按2.2.3 項(xiàng)方法稀釋成1000 μg/ml溶液；分別精密量取上述對(duì)照品溶液2.00 ml 與供試品溶液1.00 ml 置10 ml 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按照含量測(cè)定方法，計(jì)算回收率。見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.4 含量測(cè)定

采用上述兩種方法及《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版二部收載方法，對(duì)4 批茶堿緩釋片含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。含量測(cè)定結(jié)果兩兩進(jìn)行配對(duì)樣品t檢驗(yàn)（α=0.05），P值分別為0.067、0.616、0.465，說(shuō)明3種方法測(cè)得結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(%)

3 討論

3.1 容量分析法與HPLC 法比較

現(xiàn)行藥典收載的茶堿緩釋片含量測(cè)定方法為容量分析法，以茜素磺酸鈉指示液為指示劑，加入定量硝酸銀滴定液，用氫氧化鈉滴定液滴定，計(jì)算茶堿含量。指示劑變色趨勢(shì)為由黃至紫（pH 值3.7～5.2），滴定過(guò)程中，難以確定微紅色的滴定終點(diǎn)。茶堿與硝酸銀反應(yīng)生成乳白色沉淀，沉淀可干擾顏色變化，判斷終點(diǎn)難度較大。HPLC 法可以避免主觀因素對(duì)終點(diǎn)判斷的影響。

3.2 UV 法與HPLC 法比較

茶堿具有良好的紫外吸收，采用UV 法測(cè)定茶堿含量的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。但茶堿與可可堿在270～275 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收，傳統(tǒng)UV 法無(wú)法排除可可堿的干擾。在可可堿和茶堿同時(shí)存在情況下，Abuirjeie等[7]采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法和二級(jí)導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定茶堿。

與UV 法的局限與導(dǎo)數(shù)光譜法的復(fù)雜計(jì)算相比較，HPLC 法更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷。并且，茶堿緩釋片中，不僅含有可可堿，還可能有咖啡因、雜質(zhì)B、C、D[8]等干擾，UV 法無(wú)法排除相互干擾，但HPLC法可以對(duì)每個(gè)雜質(zhì)準(zhǔn)確定量。

茶堿緩釋片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下，必須采用HPLC 法，含量測(cè)定中，也采用相同的HPLC法，就可以實(shí)現(xiàn)處理一次樣品，檢驗(yàn)兩個(gè)項(xiàng)目，提高工作效率。

3.3 兩種HPLC 法比較

本文中的方法1 和方法2 的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均能達(dá)到要求，在精密度、定量限、檢出限、回收率的考察中，方法2 更具優(yōu)勢(shì)，且保留時(shí)間短，可節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

4 結(jié)論

本文對(duì)兩種HPLC 測(cè)定茶堿緩釋片含量的方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，精密度均良好；在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；回收率試驗(yàn)RSD 值均較小。HPLC 方法簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為茶堿緩釋片質(zhì)量控制的有效方法。方法2 方法學(xué)考察結(jié)果優(yōu)于方法1，并且保留時(shí)間短，可節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高工作效率。