兒童耐藥肺炎支原體DNA拷貝量與臨床預后相關(guān)性分析

朱美君

肺炎是常見的兒童疾病之一，患兒主要出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、咳痰等臨床癥狀[1]。近年來支原體肺炎的發(fā)病率逐漸升高，發(fā)病急、病情重。臨床上肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)引起的呼吸系統(tǒng)疾病不易與其他病原體區(qū)分，為臨床診治帶來一定挑戰(zhàn)。MP無細胞壁，對糖肽類、β-內(nèi)酰胺類藥物具有天然抗性，目前對于MP的治療主要采用紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等，但由于近年來大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的濫用，MP菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物出現(xiàn)明顯的耐藥性[2]。MP臨床分離培養(yǎng)較為困難，目前關(guān)于MP的耐藥性機制尚不完全清楚。研究報道，耐藥MP引起患兒治療時間及臨床癥狀持續(xù)時間延長，耐藥MP與患兒的臨床預后具有一定的相關(guān)性[3]。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量是否與臨床預后相關(guān)則未見報道，本文通過檢測耐藥MP-DNA拷貝量，分析其與臨床預后的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

2017年12月至2018年12月于本院兒科就診的合并發(fā)熱或(和)咳嗽，且1年內(nèi)反復MP感染且不規(guī)律應用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物≥2次的110例患兒納入研究組?；純褐心?6例，女44例，年齡1～8歲，平均(6.30±1.24)歲。納入標準：①年齡1～8歲，患者入院前未進行抗生素、免疫抑制劑等治療；②患兒肺部有濕啰音或哮鳴音；③患兒依從性好，家屬知情同意；④本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。排除標準：①患有免疫缺陷性疾病患兒；②患有肺結(jié)核或者哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病者；③阿奇霉素過敏或者有嚴重反應不良患兒；④伴有先天性疾病患兒。

二、方法

1 MP培養(yǎng)及藥敏試驗 用無菌棉拭子在患兒咽喉部捻轉(zhuǎn)數(shù)次采集咽拭子標本，把被檢測的棉拭子置于含有快速MP培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。陽性判斷：MP繁殖過程中分解糖類，形成 H+，引起培養(yǎng)基的pH值降低，指示劑顏色由紅色變?yōu)辄S色；陰性：培養(yǎng)基顏色變渾濁或者保持不變。本次藥敏試驗共檢測5種抗菌藥物(紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星)，根據(jù)藥物濃度由高到低，于體外對MP抑制抗菌藥物作用進行病原體耐藥性分析。

實驗步驟：取1支分裝的阿奇霉素干粉培養(yǎng)基，加入1.5 mL無菌水溶解；在藥敏陰性孔中加入50 uL培養(yǎng)基，將采集的MP標本咽拭子在培養(yǎng)基中攪動數(shù)次，取50 uL含有MP標本的培養(yǎng)液加入藥敏板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。藥敏試驗判定標準[4]：MP培養(yǎng)基上C孔為澄清藍色，則為MP陽性(+)；C孔培養(yǎng)基不變，則為MP陰性(-)。藥物敏感：A、B孔MP均為陰性(-)；重度敏感：A孔MP為陰性(-)、B孔MP為陽性(+)；耐藥：A孔MP為陽性(+)、B孔MP為陽性(+)。重度敏感按照敏感進行處理。

2 療效判定標準 依據(jù)國家衛(wèi)生計生委辦公廳、國家中醫(yī)藥管理局辦公室、解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品器材局發(fā)布的《抗菌藥物臨床應用指導原則(2015年版)》[5]將治療效果分為無效、進展、顯效、痊愈4級。有效率=(顯效例數(shù)+痊愈例數(shù))/總例數(shù)×100%。

3 熒光定量PCR 采用高溫消毒的吸痰器于患兒咽部吸取痰液1～3 mL置于無菌試管中；4倍體積4%的NaOH室溫消化30min，取1 mL至離心管中，加入濃縮液100 uL，12000r/min離心5min，棄上清，沉淀中加入50 uL核酸釋放劑；加50 uL DNA提取液于MP-DNA檢測管中，于ABI7500 Real Time 熒光定量PCR儀中檢測MP-DNA載量，依據(jù)試劑盒說明書分析檢測結(jié)果。

4 血清炎癥因子的檢測 采集患兒入院第二天清晨空腹血液，分離血清，IL-6、PCT采用ELISA法測定，hs-CRP采用免疫比濁法測定，BECKMAN CUNLTER GENS 全自動無分類血細胞分析儀檢測白細胞總數(shù)、丹麥全自動血沉儀檢測血沉。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、肺炎支原體陽性率、藥敏試驗及測序結(jié)果

經(jīng)過檢測顯示，110例研究組中MP陽性感染患兒42例，陽性率38.18%。42例紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星的敏感性及耐藥性分析(見表1)。42例MP陽性中27例阿奇霉素敏感，15例耐藥。阿奇霉素耐藥15例患兒中，1年內(nèi)阿奇霉素不規(guī)律使用2次的有2例，3次的有4例，4次的有9例，隨著不規(guī)律用藥次數(shù)的增加，耐藥比例顯著增加(P<0.05)(見表2)。

表1 42例MP陽性感染患兒的耐藥性分析 [n(%)]

表2 1年內(nèi)不規(guī)律阿奇霉素用藥次數(shù)及耐藥率分析 [n(%)]

二、治療效果及預后恢復情況的比較

根據(jù)MP耐藥情況將患兒分為耐藥組(27例)和敏感組(15例)，其中耐藥組治療2周后治愈率為59.26%(17/27)；4周后治愈率為77.78%(21/27)；敏感組治療2周后治愈率為100%(15/15)；耐藥組發(fā)熱時間、住院時間均高于敏感組(P<0.05)(見表3)。

表3 治療效果比較

三、各組MP-DNA拷貝量的比較

兩組MP-DNA拷貝量比較顯示，耐藥組MP-DNA水平顯著高于敏感組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

表4 MP-DNA拷貝量比較

四、各組炎癥因子的比較

各組炎癥因子比較顯示，耐藥組血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于敏感組，白細胞總數(shù)、PCT、血沉與敏感組比較無顯著差異(P<0.05)(見表5)。

表5 各組炎癥因子及恢復情況的比較

五、Logistic回歸分析影響耐藥肺炎支原體感染患者預后的危險因素

單因素分析發(fā)現(xiàn)，MP-DNA、hs-CRP、IL-6是影響耐藥肺炎支原體感染患者預后的危險因子(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)(見表6)。

表6 Logistic多因素回歸分析影響患者預后的危險因素

討 論

MP感染是臨床常見的兒童疾病之一，MP感染引起人肺A549上皮細胞黏蛋白表達增加，引起患兒痰液黏稠，氣道內(nèi)黏液分泌物明顯增多、壅塞，常表現(xiàn)為大葉性肺炎[6]。MP感染除引起肺部癥狀外，還引起肺外多系統(tǒng)并發(fā)癥，包括胃腸道反應、過敏反應等，部分患兒甚至出現(xiàn)多器官功能障礙或衰竭[7]。MP因為缺乏細胞壁，天然耐藥頭孢類抗生素、青霉素，但對四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯藥物敏感，兒童處于生長發(fā)育、骨骼形成階段，限制四環(huán)素類、喹諾酮類藥物在兒童中的應用，所以治療兒童MP常用大環(huán)內(nèi)酯類藥物[8]。阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的一種，主要發(fā)揮抑菌、抗炎等作用，其組織滲透性較好，對肺部感染組織的治療較好，臨床常用阿奇霉素序貫法治療兒童MP[9]。目前數(shù)據(jù)顯示，我國兒童及成年患者中分離的MP菌株對大環(huán)內(nèi)酯類具有較高耐藥性，因此研究耐藥MP患兒對臨床治療及預后具有重要意義。

趙熙婷等研究報道，阿奇霉素序貫法對耐藥性MP治療效果良好[10]。本研究中采用阿奇霉素序貫法治療2周后，多數(shù)患兒痊愈，與上述報道結(jié)果相似，提示阿奇霉素序貫法治療可用于兒童MP感染。王亞坤等研究報道，耐藥MP患兒的治療時間及病程均有所延長[11]。劉會彩等研究報道，大環(huán)內(nèi)酯類治療耐藥MP退熱時間較敏感株延長，總發(fā)熱時間較敏感株也延長[12]。本研究顯示，耐藥組治愈率低于敏感組，耐藥組治療時間和退熱時間均顯著高于敏感組，提示耐藥MP可對治療效果及臨床預后具有一定影響，與上述研究結(jié)果一致。

MP通過免疫學機制產(chǎn)生致病作用，MP感染機體后引起抗原抗體結(jié)合，激活補體，產(chǎn)生中性粒細胞趨化因子，大量白細胞聚集在病變部位，引起組織增生或者破壞性病變[13]。CRP是典型的急性期時相蛋白，是介導炎癥反應的重要炎癥因子，并且通過與炎癥損傷細胞暴露的磷脂結(jié)合啟動免疫應答[14]。PCT是甲狀腺分泌的降鈣素前體物質(zhì)，機體正常狀態(tài)下只存在少量，但當機體感染時PCT水平則會顯著升高[15]。研究顯示PCT與細菌感染程度呈正相關(guān)。IL-6是MP反應中的重要炎癥因子，在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用，研究顯示，IL-6在炎癥反應早期異常增高，誘導T細胞分化，促進炎癥因子的分泌，IL-6水平可能與MP感染的嚴重程度和臨床預后相關(guān)[16]。本研究中耐藥組患兒血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于對照組，白細胞數(shù)、PCT也高于對照組，與上述研究結(jié)果一致，炎性因子水平的升高可能與耐藥MP表面的基因型變化，免疫損傷和炎癥反應持續(xù)時間延長相關(guān)。

MP-DNA拷貝量客觀反映了MP與宿主免疫清除能力之間的平衡。研究報道，MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型的改變，引起敏感株的增殖受到抑制，而耐藥株的增殖不受抑制，進而引起感染患者MP-DNA拷貝量的差異；且MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型改變引起抗生素與核糖體親和力改變[4]。本研究中耐藥菌組患兒MP-DNA拷貝量顯著高于敏感組，且耐藥株2周治愈率低于敏感組，治療時間高于敏感組，這可能與敏感組MP增殖力減弱、抗生素親和力降低有關(guān)。COX多因素回歸分析顯示，MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預后的獨立危險因素，提示可根據(jù)患者MP-DNA拷貝量、hs-CRP水平采取合適的治療方法進一步改善患者預后情況。

綜上所述，耐藥組患兒MP-DNA拷貝量高于敏感組MP-DNA拷貝量，且是影響臨床預后的獨立危險因素之一。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量與臨床預后的具體作用機制有待進一步研究。