核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定磷酸伯氨喹片中磷酸伯氨喹的含量?

王斌，張永紅，劉文濤，劉晨江?

(1.新疆大學(xué)理化測試中心，新疆烏魯木齊830046；2.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

核磁共振定量分析（qNMR）方法是以結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的分析方法，具有簡便快速、對樣品無破壞性、重現(xiàn)性好、無需待測物的高純標(biāo)準(zhǔn)品等優(yōu)勢[1?4].隨著現(xiàn)代超導(dǎo)高磁場的脈沖Fourier變換核磁共振譜儀的應(yīng)用，qNMR方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精確度及分析速度等方面已達(dá)到或接近高效液相色譜的水平[5]，是解決無標(biāo)樣定量分析問題的重要途徑.近年來，qNMR 方法在化學(xué)化工、醫(yī)藥生物、農(nóng)業(yè)食品和代謝組學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[6?13]，中國藥典于2010 版開始將該技術(shù)作為法定標(biāo)準(zhǔn)收載于通則( 附錄)中[14,15].因此，qNMR方法應(yīng)用于藥物定量分析已成為趨勢，是鑒別假冒、偽劣藥品的有效方法，對管理我國的藥品市場也有著重大的意義.

瘧疾是目前全球倍受關(guān)注的三大疾病之一.非洲、中南美洲和東南亞的多數(shù)國家和地區(qū)是瘧疾的高流行地區(qū)，尤其是惡性瘧流行仍較嚴(yán)重.磷酸伯氨喹片是一種抗虐藥，用于防治間日瘧、三日瘧的復(fù)發(fā)和傳播[16?19].目前，在非洲及東南亞等瘧疾多發(fā)地該藥仍被廣泛使用，在國內(nèi)也被作為戰(zhàn)略物資，其原料及片劑一直被保留生產(chǎn).磷酸伯氨喹片有關(guān)物質(zhì)的測定，各國藥典方法也各不相同，《中國藥典》2010年版采用的是薄層色譜法(TLC)，該方法精確度差，且主斑點與主要雜質(zhì)喹西特斑點分離度不夠；《英國藥典》2015年版采用正相高效液相色譜法(NP-HPLC)，該方法操作繁瑣，使用溶劑為揮發(fā)性有機(jī)溶劑，因此配制的溶液容易揮發(fā)造成誤差，分離效果及檢測靈敏度也差；《美國藥典》38版采用反向高效液相色譜法(RP-HPLC)，該方法操作較為簡便，分離效果尚可，準(zhǔn)確度高，但需要將藥品進(jìn)行預(yù)分離處理，除去藥品外層包裹的糖衣，且需要磷酸伯氨喹標(biāo)準(zhǔn)對照品.本文在對比各國藥典標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，建立了一種核磁共振內(nèi)標(biāo)法，簡單、快速并且無需對照品測定磷酸伯氨喹片中磷酸伯氨喹含量的方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Varian Inova-400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（美國VARIAN安公司，DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)）；KQ-100型超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司）；ER-182A型電子分析天平（日本AND公司）.

試劑：磷酸伯氨喹片（某制藥公司，規(guī)格：13.2 mg，批號：110601）；磷酸伯氨喹標(biāo)準(zhǔn)品（試劑級，純度98%，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；氘代二甲基亞砜(美國CIL公司，氘代度99.8%，0.03% V/V TMS)；對苯二酚（試劑級，純度99%，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣準(zhǔn)備

準(zhǔn)確稱量一顆磷酸伯氨喹片(100.8 mg)，用瑪瑙研缽研磨成粉末，混合均勻，稱取上述過程處理的藥品粉末20.4 mg加入核磁樣品管中，然后加入1.1 mg內(nèi)標(biāo)物對苯二酚，再加入DMSO-d6溶劑振蕩溶解.

1.2.21H-NMR測試條件

測定溫度為50℃，檢測頻率為399.74 MHz，譜寬為6 999.70 Hz，90o脈沖寬度為10.80μs，采集時間為3.74 s，延遲時間為10.00 s，采集次數(shù)為100次.圖譜處理時手動進(jìn)行相位校正和基線校正，對內(nèi)標(biāo)物和樣品的定量峰分別進(jìn)行5次積分，取其平均值，得到積分結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 氘代溶劑的選擇

稱取多份20.0 mg經(jīng)過研磨的磷酸伯氨喹片粉末，分別加入氯仿、甲醇、丙酮、二甲基亞砜、水等常用溶劑0.5 mL，通過振蕩、超聲輔助溶解10 min后，發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜對樣品的溶解性最佳，并且通過試驗內(nèi)標(biāo)物對苯二酚也易溶于二甲基亞砜，因此選擇氘代二甲基亞砜為溶劑.

2.2 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

內(nèi)標(biāo)物應(yīng)具有含量準(zhǔn)確、純度高、性質(zhì)穩(wěn)定、溶解性良好、不與待測樣品相互作用或反應(yīng)，其定量峰與樣品的信號峰不重疊等特點.內(nèi)標(biāo)物與待測物制成混合溶液，通過核磁譜圖上相應(yīng)定量峰的積分信號強(qiáng)度的比值可確定待測物的含量[1].常用的內(nèi)標(biāo)物有鄰苯二甲酸氫鉀、順丁烯二酸、反丁烯二酸、對苯二甲醛、對苯二酚、苯、苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸、2，3，5-三碘苯甲酸、2，4-二硝基甲苯、3，4-二硝基甲苯、二氧六環(huán)等[20].根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在選定溶劑DMSO-d6中的溶解性和MestReNova軟件模擬內(nèi)標(biāo)物和待測樣品的核磁氫譜，內(nèi)標(biāo)物對苯二酚的兩組峰均為單峰，且與待測樣品的譜峰沒有重疊，與定量峰的間距也較為合理，故選擇對苯二酚為內(nèi)標(biāo)物.

2.3 1H-NMR譜峰歸屬

圖1 磷酸伯氨喹分子結(jié)構(gòu)Fig 1 Molecular structure of primaquine phosphate

分別對磷酸伯氨喹標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)物對苯二酚、磷酸伯氨喹片粉末和內(nèi)標(biāo)物混合樣品進(jìn)行1H-NMR檢測，對比圖2中各圖.磷酸伯氨喹的1H-NMR譜峰歸屬為δ：1.22 (s,2H,NH2),1.24 (d,3H,CH3),1.65(m，4H，2CH2),2.79 (t,2H,CH2),3.65 (m,1H,CH),3.83 (s,3H,OCH3),6.13 (s,1H,NH),6.29 (d,1H,CH),6.48 (d,1H,CH),7.42 (dd,1H,CH),8.07 (dd,1H,CH),8.53 (d,1H,CH)，磷酸分子中的6個氫和DMSO-d6溶劑中的殘留水的質(zhì)子之間產(chǎn)生氫鍵作用，在δ：4.2～5.7處產(chǎn)生了一個寬峰.內(nèi)標(biāo)物的1HNMR譜峰歸屬為δ：6.55(s,4H,CH)，8.57(s,2H,2OH).圖2中C譜圖在δ：3.0～4.0處出現(xiàn)的幾組峰為藥片糖衣中的糖成分所出的譜峰，δ：4.4～5.8處出現(xiàn)的寬峰為磷酸分子中的6個氫、內(nèi)標(biāo)物中的2個OH活波氫和DMSO-d6溶劑中的殘留水的質(zhì)子之間產(chǎn)生氫鍵作用所產(chǎn)生的譜峰，由于三種不同氫核的氫鍵作用，化學(xué)位移較標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物發(fā)生了一定變化.

圖2 1H-NMR譜圖Fig 2 1H-NMR spectrum

2.4 定量峰的選擇

定量峰應(yīng)滿足在選定的積分范圍內(nèi)無干擾，在此基礎(chǔ)上應(yīng)選擇比較規(guī)則的信號峰以減小積分誤差.如圖2所示，內(nèi)標(biāo)物對苯二酚δ：6.55處為尖銳單峰，在磷酸伯氨喹藥品分子中，δ：7.42、8.07、8.53處分別有一個峰型規(guī)則的峰，并且和內(nèi)標(biāo)物的峰之間沒有重合，相互沒有干擾，因此理論上均可以作為定量峰計算含量.但實際測試結(jié)果（見表1）表明：以化學(xué)位移在δ：8.07處作為定量峰測試的結(jié)果相對誤差為0.84%，誤差最小，因此選擇化學(xué)位移在δ：8.07處的峰作為最佳定量峰.

2.5 回收率試驗

采用加標(biāo)回收法，在已知含量的樣品中加入適量的磷酸伯氨喹標(biāo)準(zhǔn)品每個添加水平測定3次按1.221H-NMR測試條件測定計算回收率，結(jié)果見表1.由表1可以看出，磷酸伯氨喹的回收率在97.8～102.7%之間，平均回收率為99.8%.表明該方法重復(fù)性良好，該結(jié)果證實所建立的qNMR方法能夠應(yīng)用磷酸伯氨喹片中磷酸伯氨喹含量測定.

表1 qNMR 方法回收率試驗結(jié)果(n = 3)Tab 1 Recovery test results of qNMR method

2.6 磷酸伯氨喹定量分析結(jié)果

根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)物分子配制時質(zhì)量、定量峰的質(zhì)子數(shù)及核磁譜圖中定量峰的積分面積比值，可以測定樣品中磷酸伯氨喹的百分含量Ws，計算公式如下：

其中As是被測樣品定量峰的積分面積，ns是被測樣品定量峰包含的質(zhì)子數(shù)量，Ms是被測樣品的分子質(zhì)量，Ar是內(nèi)標(biāo)物定量峰的積分面積，nr是內(nèi)標(biāo)物定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Mr是內(nèi)標(biāo)物的分子質(zhì)量，mr是加入的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，Wr是內(nèi)標(biāo)物的純度，ms是樣品質(zhì)量.

測試藥品重100.8 mg，標(biāo)示磷酸伯氨喹含量為13.2 mg，因此磷酸伯氨喹含量為13.10%.實際測試計算結(jié)果見表2.結(jié)果表明：分別以δ：7.42、8.07、8.53的三個單質(zhì)子峰作為定量峰計算得到的磷酸伯氨喹含量Ws為12.86%、12.99%、13.25%，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對誤差均小于2%，以化學(xué)位移在δ：8.07處最佳定量峰計算結(jié)果的相對誤差相對最小，為0.84%，測試結(jié)果最為準(zhǔn)確可靠.

表2 不同的定量峰計算的磷酸伯氨喹含量Tab 2 Determination of primaquine phosphate content by different quantitative peaks

3 結(jié)論

本文采用qNMR法測定了磷酸伯氨喹片中磷酸伯氨喹的含量，測定無需分離過程和對照品，樣品配制簡單，可有效減少樣品前處理對測定結(jié)果的影響.建立的qNMR法同時實現(xiàn)了磷酸伯氨喹片中磷酸伯氨喹的定性鑒別與定量分析，且操作簡單、快速、省時，測定結(jié)果與標(biāo)示值相對誤差較小，說明該方法計算結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠.qNMR方法應(yīng)用于藥物定量分析應(yīng)用也已成趨勢，在藥物質(zhì)量控制包括有效成分鑒別、含量測定及雜質(zhì)檢測等的應(yīng)用將日益廣泛，是鑒別假冒、偽劣藥品的有力武器，對監(jiān)管我國的藥品市場也有著重大的意義.