量子點(diǎn)/多孔硅光子晶體生物傳感器用于檢測(cè)鏈霉親和素?

王佳佳，李彥宇，賈振紅

(1.新疆大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)博士后流動(dòng)站，新疆烏魯木齊830046；2.新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

0 引言

在過去的十幾年中，多孔硅（PSi）作為一種生物兼容性強(qiáng)的傳感基底材料被廣泛研究[1?4].與光學(xué)傳感材料一樣，作為基于折射率變化的多孔硅傳感器對(duì)吸附在其表面的分子具有響應(yīng)速度快、靈敏度高的特點(diǎn)[5?7].多孔硅基底光學(xué)傳感器通過熒光光譜分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)以及生物檢測(cè)[8,9].此外，與基于折射率變化的檢測(cè)方法（檢測(cè)濃度為μM）相比，基于熒光變化的檢測(cè)方法（檢測(cè)濃度為nM）具有更高的靈敏度.因此，基于熒光變化的檢測(cè)系統(tǒng)能夠檢測(cè)到更微弱的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏的生物檢測(cè).

自從發(fā)現(xiàn)多孔硅的室溫光致發(fā)光以來，多孔硅的發(fā)光特性引起了物理學(xué)家的廣泛關(guān)注.起初，單層多孔硅作為傳感基底，主要通過Er摻雜能夠?qū)崿F(xiàn)在紅外波段的光致發(fā)光[10]；通過離子輻照引起的缺陷來實(shí)現(xiàn)發(fā)光猝滅[11]；通過多孔硅的熒光猝滅法確定抗體溶液的pH值對(duì)固定化過程的影響[12].后來，單層多孔硅基底被用來檢測(cè)生物分子，降低了染料分子標(biāo)記的MS2病毒的檢測(cè)限[13]，并通過熒光恢復(fù)實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)[14].隨著人們對(duì)多孔硅研究的逐漸深入，微腔器件的腔層具有提高單位體積內(nèi)光子能量的作用，因此多孔硅微腔作為傳感器基底用來收窄熒光物質(zhì)的出射熒光[15,16].近年來，人們考慮利用多孔硅光子晶體具有高反射帶的特性，減少出射熒光在基底中的損失，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光物的出射熒光的增強(qiáng)[17,18].

量子點(diǎn)（QDs）由于熒光量子產(chǎn)率高、折射率大的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于發(fā)光器件、生物傳感器中[19?21].單層多孔硅與CdTe/CdS量子點(diǎn)的混合結(jié)構(gòu)界面氧化能夠影響發(fā)光性能[22].量子點(diǎn)/多孔硅混合金屬半導(dǎo)體光電探測(cè)器能夠提高光響應(yīng)度[23].用CdTe/CdS量子點(diǎn)沉積在SiO2納米柱陣列上能夠?qū)崿F(xiàn)光致發(fā)光的增強(qiáng)，這種增強(qiáng)主要是由于粗糙表面對(duì)量子點(diǎn)吸附量的增加和二維光子晶體帶隙結(jié)構(gòu)光波調(diào)制表面場(chǎng)的增強(qiáng)[24].因此，光子晶體與量子點(diǎn)的新型混合結(jié)構(gòu)可以用作高靈敏度的光學(xué)生物傳感器的制備.

生物素和鏈霉親和素的反應(yīng)具有很高的特異性，是許多臨床試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)的重要手段[25].生物親和性共軛已被廣泛用于連接供體和受體，以研究共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)距離的依賴性[26].此外，利用生物素和鏈霉親和素相互識(shí)別作用，也可以實(shí)現(xiàn)基于局域表面等離子體共振位移變化的生物傳感器[27].蛋白質(zhì)、脂類、DNA和其他生物大分子通過生物素和鏈霉親和素間的相互作用與傳感器基底實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接[28,29].盡管生物素和鏈霉親和素的結(jié)合已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道過，但在量子點(diǎn)的熒光檢測(cè)中的應(yīng)用還很少.更重要的是，正如我們之前報(bào)道的，量子點(diǎn)/多孔硅光子晶體的嫁接結(jié)構(gòu)是通過生物素-鏈霉親和素特異性結(jié)合技術(shù)實(shí)現(xiàn)的[30].隨后，我們制備并更具體的描述這種嫁接結(jié)構(gòu)的生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，并且實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè).

本文中，水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的生物素與鏈霉素修飾的多孔硅光子晶體相連接.當(dāng)鏈霉親和素和生物素發(fā)生反應(yīng)時(shí)，量子點(diǎn)與多孔硅孔間接相連.光子晶體的高反射帶增強(qiáng)了量子點(diǎn)的出射熒光信號(hào)，使得傳感器實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的生物檢測(cè).

1 材料和方法

1.1 多孔硅的制備

實(shí)驗(yàn)選擇的是高摻雜p型<100>單晶硅片(電阻率0.03～0.06 ?·cm).腐蝕之前，分別用乙醇、去離子水和超聲波清洗硅片10min，用40%氫氟酸和無水乙醇按1:1（v/v）的比例混合的電解質(zhì)溶液對(duì)硅片進(jìn)行電化學(xué)陽極腐蝕.實(shí)驗(yàn)中光子晶體設(shè)置為26層.第一層是生物分子的吸附層，第二層是隔離層，其余的24層是一個(gè)12個(gè)周期的低折射率和高折射率交替周期變化的分布式布拉格反射鏡層.表1給出了制備多孔硅樣品的電流密度以及多孔硅薄膜的有效折射率和厚度值.在功能化之前，用去離子水（DI）清洗基底并在氮?dú)猸h(huán)境中干燥.多孔硅樣品的模擬反射光譜如圖1所示，中心帶隙波長(zhǎng)位于533nm.

表1 多孔硅光子晶體的主要參數(shù)Tab 1 Parameters of Selected PSi Samples

1.2 多孔硅樣品的功能化

多孔硅傳感器的制備步驟主要有氧化、硅烷化、戊二醛、鏈霉親和素連接等步驟.為了提高多孔硅器件的穩(wěn)定性，新制備的多孔硅樣品室溫下在H2O2（30%）溶液中氧化24h.氧化后的多孔硅樣品在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES 4%）溶液（APTES:DI:甲醇=10:10:1，v/v）中浸泡1h，然后用乙醇和DI徹底沖洗，氮?dú)猸h(huán)境中干燥，在真空干燥箱（100℃）中充分干燥10min后，用戊二醛溶液（2.5%）對(duì)硅烷化后的多孔硅樣品醛基化1h，以形成偶聯(lián)基團(tuán).用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH:7.4）和去離子水反復(fù)清洗多孔硅樣品3次，每次5min，去除多余的戊二醛分子，自然干燥保存.

圖1 MATLAB模擬的多孔硅光子晶體的反射光譜Fig 1 The simulation reflectance spectrum of PSi sample using MATLAB

1.3 鏈霉親和素與功能化多孔硅連接

用移液器取50μL不同濃度的鏈霉親和素（0.1nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM）分別滴在功能化的多孔硅樣品上，在37℃培養(yǎng)箱中放置2h后，用PBS（pH=7.4）反震蕩清洗樣品三次，每次5min，除去未連接的鏈霉親和素分子，并在氮?dú)猸h(huán)境中干燥.然后用3M乙醇胺緩沖液（EA，ph=9.0）封閉抑制非特異性的反應(yīng)，并且用PBS震蕩清洗樣品5min后，自然干燥保存.

1.4 生物素的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中使用的探針分子是水溶性羧基QDs（CdSe/ZnS）標(biāo)記的生物素(QDs-生物素).QD-生物素的大小約為7nm，熒光峰位于535nm.圖2為QD- 生物素的吸收光譜和熒光光譜，最強(qiáng)吸收峰位于510nm處.用移液管取50μL 的QD-生物素滴加到連接有鏈霉親和素的多孔硅樣品上，在37℃恒溫箱中放置2h，待鏈霉親和素和生物素充分反應(yīng)，用PBS沖洗5min，除去未反應(yīng)的QD-生物素，并且自然干燥.熒光光譜測(cè)量使用的是紫外可見熒光分光光度計(jì)（Hitachi F-4600，日本），狹縫寬度為5nm，激發(fā)功率400mW，從樣品中采集5個(gè)不同點(diǎn)的數(shù)據(jù)并取平均.反射光譜的收集使用的是紫外-可見分光光度計(jì)（Hitachi U-4100，日本）.多功能場(chǎng)發(fā)射掃描式電子顯微鏡FESEM（蔡司Supra55 VP，德國(guó)）用來測(cè)量多孔硅樣品的表面和截面形貌.

圖2 QD標(biāo)記的生物素的紫外吸收光譜和熒光光譜Fig 2 Absorption spectrum and fluorescence spectrum of OD-biotin

2 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)選擇的光子晶體器件分為三部分，光子晶體器件的截面如圖3（a）所示.第一部分是高電流密度制備的生物分子識(shí)別層，孔徑約30nm，如圖3（b）所示.這保證了即使多孔硅的孔徑由于功能化過程中分子的吸附而減小，孔徑也能滿足7nm的QD-生物素分子進(jìn)入到多孔硅孔洞內(nèi)的要求.為了保證生物分子只能進(jìn)入生物識(shí)別層，因此光子晶體的第二層設(shè)計(jì)為孔徑為10nm的隔離層，如圖3（c）所示.第三部分是具有低折射率和高折射率周期變化的布拉格反射鏡，高反射禁帶的中心波長(zhǎng)為533nm.按照上述條件設(shè)置多孔硅光子晶體的目的是為了實(shí)現(xiàn)QD-生物素只分布在生物分子的識(shí)別層，避免進(jìn)入布拉格反射鏡層，便于研究布拉格反射鏡對(duì)量子點(diǎn)熒光的增強(qiáng).

圖3 多孔硅光子晶體的掃描電鏡圖Fig 3 SEM images of the PSi photonic crystal.

圖4 QD-生物素（0.1nM）在功能化多孔硅單層器件和光子晶體基底上的熒光光譜Fig 4 Fluorescence spectra of QD-biotin ( 0.1 nM)infiltrated inside the functionalized PSi single layer device and photonic crystal

通過氧化、硅烷化、戊二醛和鏈霉親和素連接等步驟實(shí)現(xiàn)了多孔硅傳感器的制備.反射光譜隨著每一步功能化的移動(dòng)幫助我們確認(rèn)傳感器的成功制備[30].量子點(diǎn)-生物素進(jìn)入到多孔硅光子晶體中使得熒光信號(hào)增強(qiáng)的現(xiàn)象對(duì)這種納米混合結(jié)構(gòu)在生物傳感上的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義.為了更直觀的觀察多孔硅光子晶體在生物傳感應(yīng)用的優(yōu)越性，我們期望在多孔硅光子晶體器件上檢測(cè)的QD-生物素表現(xiàn)出不同于單層多孔硅襯底上檢測(cè)的QD-生物素的熒光發(fā)射特性.本實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)比器件的單層多孔硅采用的是低折射率（110mA/cm2）的多孔硅薄膜.QD-生物素探針與靶鏈霉親和素分子發(fā)生親和反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了完整的生物檢測(cè).多孔硅固體基質(zhì)上的QD-生物素的熒光曲線（熒光峰530 nm），與溶液（熒光峰535 nm）相比，QD-生物素的熒光光譜曲線發(fā)生了偏移，圖4顯示了這一趨勢(shì)變化.光譜位移的變化主要是因?yàn)樯锼睾玩溍褂H和素的特異性反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)光中心的移動(dòng).本研究中在同等條件下制備兩種類型的多孔硅器件進(jìn)行QD-生物素檢測(cè)，即多孔硅光子晶體和單層多孔硅基底.從這兩種結(jié)構(gòu)器件基底上檢測(cè)到的QD-生物素的出射熒光的峰位的移動(dòng)，表明QD-生物素和鏈霉親和素發(fā)生特異性反應(yīng).與單層多孔硅相比，多孔硅光子晶體上檢測(cè)到的QD-生物素的熒光增強(qiáng)與光子晶體的光波調(diào)制有關(guān).量子點(diǎn)共軛物（QD-生物素與鏈霉親和素耦合反應(yīng)的共軛）的熒光發(fā)射峰位于530nm，恰好位于多孔硅光子晶體的帶隙范圍內(nèi).帶隙的高反射率帶有效地阻止了光波在該波段的繼續(xù)傳播，使得檢測(cè)到更多的出射熒光，從而提高了量子點(diǎn)共軛物的熒光強(qiáng)度.多孔硅的大比表面積提高了探針分子的吸附能力，隔離層可以有效地阻止生物分子進(jìn)入布拉格反射鏡.探針分子集中在第一層，可以增強(qiáng)QD-生物素的熒光強(qiáng)度，高反射帶隙可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)出射熒光增強(qiáng).從實(shí)驗(yàn)中可以得出，在多孔硅光子晶體器件基底上，量子點(diǎn)共軛物的熒光強(qiáng)度是單層多孔硅基底上檢測(cè)的熒光強(qiáng)度的2倍（圖4中曲線的強(qiáng)度比）.

多孔硅光子晶體生物傳感器通過檢測(cè)不同濃度（0.1nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM）的鏈霉親和素功能化的多孔硅光子晶體和固定濃度的QD-生物素（2.5nM）的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)濃度與熒光信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)性檢測(cè).從圖5中可以觀察到，隨著鏈霉親和素濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).在QD/多孔硅光子晶體復(fù)合材料中，由于多孔硅具有大比表面積，可以降低因熒光團(tuán)聚集而引起的猝滅.因此，這種納米混合系統(tǒng)對(duì)低濃度的生物檢測(cè)具有較強(qiáng)吸引力.

圖5 量子點(diǎn)-共軛物的熒光隨鏈霉親和素濃度變化Fig 5 The fluorescence intensity of QD-conjugate in PSi increased with the increased of streptavidin concentration

圖6 量子點(diǎn)-共軛物熒光強(qiáng)度與鏈霉親和素濃度的線性關(guān)系圖Fig 6 Relationship between the fluorescence intensity of QD-conjugate and streptavidin concentration

圖6記錄了在不同濃度的鏈霉親和素作用下，量子點(diǎn)-生物素在多孔硅光子晶體基底上的熒光強(qiáng)度變化.線性方程為y=405.3+403.5x，擬合系數(shù)為0.995，其中y代表QD共軛物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，x代表鏈霉親和素濃度.多孔硅光子晶體生物傳感器的檢測(cè)限為17.3μM.LOD=3σ/s，其中σ是空白測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s是線性方程的斜率.與基于多孔硅光子晶體的反射式生物傳感器（檢測(cè)限為nM）相比[31?33]，基于熒光檢測(cè)技術(shù)手段的多孔硅光子晶體生物傳感器的LOD降低了3個(gè)數(shù)量級(jí).

3 結(jié)論

光子晶體結(jié)構(gòu)是制作高靈敏度生物傳感器的一種可行方法.利用熒光檢測(cè)技術(shù)手段，通過QD-生物素與固定在多孔硅基底上的鏈霉親和素的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè).相對(duì)于單層多孔硅，多孔硅光子晶體的高反射率帶隙使得檢測(cè)的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了一倍，提高了光學(xué)生物傳感器的靈敏度，檢測(cè)限為pM.結(jié)果表明，基于光子晶體的生物檢測(cè)傳感器具有良好的特異性和高靈敏度，將進(jìn)一步應(yīng)用在生物檢測(cè)上.