模擬氮沉降對馬尾松土壤微生物群落結構及溫室氣體釋放的影響

張 雪,梅 莉,宋利豪,劉力誠,趙澤堯

華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院,湖北省林業(yè)信息工程技術研究中心,武漢 430070

土壤呼吸(Soil respiration)是全球溫室氣體釋放的重要來源[1- 2]。即使土壤呼吸有較小比例的波動都會對大氣組成及氣候變化產(chǎn)生較大的影響[3- 5]。土壤呼吸對土壤環(huán)境變化非常敏感,如全球變暖、氮沉降、林分經(jīng)營及植被破壞等都將影響土壤呼吸及溫室氣體的釋放[6- 7]。森林是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主體,因此研究影響森林土壤呼吸的因素及其驅(qū)動機制對預測全球變化背景下的森林碳循環(huán)以及森林的碳匯功能具有重要意義。

大氣氮(N)沉降、施用氮肥的經(jīng)營措施常常導致林地土壤的氮含量增加[8- 9],在此背景下,森林土壤環(huán)境、土壤溫室氣體釋放對增氮的響應機制成為生態(tài)學關注的熱點。以往研究表明,土壤氮增加對土壤溫室氣體釋放的影響受多種因素調(diào)控,受立地條件、植被類型等影響而表現(xiàn)出不一致的結果。如對亞熱帶常綠闊葉林增施氮肥提高了土壤CO2的釋放量[10],也有增施氮肥抑制了土壤呼吸[11]以及對土壤呼吸速率影響并不顯著的報道[12],氮沉降及增施氮肥對溫室氣體釋放的影響及其驅(qū)動機理有待進一步的研究。

根系呼吸不僅是土壤呼吸的重要組成部分,林木細根還可以通過改變土壤微環(huán)境而影響森林土壤的生物化學過程,進而成為驅(qū)動土壤溫室氣體(CO2、N2O)釋放的重要因素[13]。研究表明,土壤呼吸與細根生物量呈顯著正相關[14],在森林土壤氮增加的情況下,根系生物量和根長密度等也將發(fā)生變化[15],這種變化又直接或間接改變根際土壤礦質(zhì)養(yǎng)分及微生物群落結構等,進而影響土壤溫室氣體的釋放。土壤呼吸速率隨根系生物量的增加而增加[16- 17],去除根系使土壤呼吸速率大幅降低[18]。根系養(yǎng)分含量的差異也會改變土壤的呼吸速率,如Volder等[19]研究發(fā)現(xiàn),根系氮含量降低會通過減少根系對土壤養(yǎng)分以及水分的吸收作用來降低土壤與根系的呼吸速率,而根系氮含量增加有利于根系的呼吸[20]。然而,在全球氮沉降及林地施肥背景下,根系生物量及氮含量的差異及土壤養(yǎng)分、微生物等理化環(huán)境對施肥的響應,以及這種響應如何影響土壤呼吸及溫室氣體釋放尚有待進一步研究。

馬尾松(Pinusmassoniana)具有生長快、適應性強等特征,是我國南方最重要的造林樹種之一,在區(qū)域生態(tài)環(huán)境建設和林產(chǎn)品供給方面發(fā)揮重要作用。本研究以馬尾松土壤為對象,通過施氮肥和不同種植密度處理,研究在不同根系生物量條件下,增加土壤氮對馬尾松土壤理化性質(zhì)、微生物群落結構及溫室氣體釋放的影響。旨在闡明氮沉降及施氮肥對溫室氣體釋放的驅(qū)動機理,并為馬尾松人工林的科學經(jīng)營提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

2016年10月,將2年生馬尾松播種容器苗分別1株和3株移栽入5 L花盆,栽培基質(zhì)是用河沙∶蛭石∶泥炭土∶黃泥土1∶1∶1∶1比例均勻混合,基質(zhì)pH值6.85±0.11,全氮2.39±0.09 g/kg、全磷0.56±0.01 g/kg、全鉀6.43±0.26 g/kg、有機質(zhì)64.32±4.33 g/kg。為了研究不同根系生物量對土壤理化性質(zhì)和土壤呼吸的影響,本實驗分單株和3株混合栽植,并分別進行不施肥和施肥,共4個處理。施肥處理：于2017年4—6月分3次施入氮肥(尿素)溶液,共施入180 mg N/盆(等同于林地10 g N/m2);不施肥處理澆同樣體積的水,以6月22日最后一次施肥為處理開始時間。每個處理30盆,共計120盆。

1.2 植物和土壤取樣與分析

2017年6月18日開始取土壤和植物樣品,每周進行一次植物取樣,每個處理每次取4盆重復;實驗7天和30天后分別取土壤和植物樣品,每次每處理取3個重復。先將地上部分莖葉剪下,再將花盆倒扣取出根系植株分根、莖、葉進行保存。植株取出時,將根系附近的土壤輕輕抖落混勻,過2 mm土壤篩,后裝于密封袋并放置于4℃冰箱保存,于1個月內(nèi)測定土壤pH值、速效氮、全氮等理化指標。將取回的植株洗凈后按根、莖、葉分別裝于信封中,并放在65 ℃烘箱中烘干至恒重,稱量獲得干重。烘干后的植物粉碎過0.5 mm(40目)篩后進行保存,用于測定根、莖、葉的非結構性碳水化合物(TNC)和全氮含量。

土壤pH值測定采用水浸提-電位法測定;土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量利用流動分析儀進行測定;植物全氮采用凱式定氮法測定;土壤微生物量碳(Soil microbial biomass carbon,SMBC)、土壤微生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen,SMBN)含量采用氯仿熏蒸-氯化鉀浸提,用TOC儀進行測定[21];土壤微生物群落結構采用磷脂脂肪酸法(Phospholopid Fatty Acid,PLFA)進行分析。

1.3 土壤呼吸速率及溫濕度測定

土壤CO2和N2O釋放速率的測定采用靜態(tài)箱-氣象色譜法進行測定。每個處理隨機安裝5個重復的土壤靜態(tài)箱。靜態(tài)箱由聚氯乙烯(PVC)管制成(規(guī)格：口徑275 mm,高200 mm,底徑180 mm),于實驗開始前1周按壓入土壤5 cm,周圍土壤緊密壓實防止漏氣。于2017年6月18日—2017年7月11日期間每2天取1次,于2017年7月11日—2017年7月18日期間每3天取1次,于2017年7月18日—2017年8月18日期間每15天取1次。

于8:00—9:00 am密封PVC管,分別于密封前、密封培養(yǎng)兩小時后取氣,每次每處理隨機取3個重復,將取出的氣體裝入真空瓶帶回實驗室,立即用氣相色譜儀(Agilent 7890A)測定CO2、N2O的濃度,并計算土壤單位面積單位時間內(nèi)的CO2、N2O的釋放速率。

土壤CO2、N2O釋放速率計算方法：

F=ρ×V/M×Δc/Δt×273/T×α

式中：F為CO2、N2O的釋放速率,正值為釋放,負值為吸收,ρ為標準狀況下氣體的密度,CO2、N2O的密度分別為1.978 kg/m3、1.98 kg/m3,V是采樣箱體積(m3),M為采樣箱底部土壤干重(g),Δc/Δt為在特定時間內(nèi)的氣體濃度變化速率,密閉時間2 h;T為采樣點的絕對溫度：開氏溫度;α分別為N2O換算到N(28/44)、CO2換算到C(12/44)的轉換因子;N2O需要乘以1000,得到單位是mg kg-1h-1,CO2直接得到單位是mg kg-1h-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析,當方差分析結果表現(xiàn)為顯著性差異時,通過Turkey檢驗進行不同處理間的多重比較,用Pearson法對土壤呼吸CO2、N2O與各影響因子進行相關性分析,利用逐步回歸分析確定影響土壤溫室氣體釋放的主要控制因子,使用Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 植株生物量和氮含量

處理30天后,單株種植的馬尾松苗地上、地下部分生物量均小于3株種植的總生物量。不施肥處理下,單株的葉片和根系氮含量均顯著大于3株種植。施氮處理對單株種植幼苗各部分生物量無顯著影響,但顯著降低了3株種植地上部分生物量(表1)。無論是單株還是3株種植,增施氮肥均顯著增加了根、莖、葉的氮含量(表1)。

2.2 土壤pH值及速效氮

無論是對照還是施肥在施氮肥處理7天后,單株種植土壤pH值顯著降低(P<0.05),3株種植平均土壤pH值也有所降低,但差異不顯著(P>0.05);施氮肥處理后,隨著時間的延長至30天,各處理土壤pH值差異不顯著。單株種植的土壤速效氮含量高于3株,施氮肥顯著增加了單株和3株種植的土壤硝態(tài)氮含量,而對土壤銨態(tài)氮含量影響不顯著(表2);隨著處理時間延長至30天后,土壤硝態(tài)氮含量顯著下降,但施肥處理仍顯著大于未施肥處理。處理7天后,3株種植的土壤速效氮含量顯著低于單株種植速效氮含量;處理30天后,單株和3株對照之間、單株和3株種植施肥之間速效氮差異不顯著(表2)。

表1 不同處理馬尾松幼苗生物量和氮含量的影響(均值±標準誤)(n=3)

順序調(diào)整為：SCK，單株對照； SF，單株施肥；TCK，3 株對照； TF，3 株施肥;字母相同表示在P=0．05(Turkey 檢驗)水平無顯著性差異

表2 馬尾松幼苗土壤pH 值及速效氮含量(均值±標準誤)(n=3)

速效氮=硝態(tài)氮+銨態(tài)氮

2.3 土壤微生物量碳、微生物量氮含量及微生物群落結構

圖1 施肥對馬尾松幼苗土壤微生物量碳、微生物量氮的影響Fig.1 Effects of N fertilization on soil microbial biomass carbon(SMBC)and soil microbial biomass nitrogen(SMBN)contents of Pinus massoniana seedlings SCK,單株對照; SF,單株施肥;TCK,3株對照; TF,3株施肥。字母相同表示在P=0.05(Turkey 檢驗)水平無顯著性差異,n=3

除單株種植處理7天時SMBC與對照沒有顯著差異外,施氮肥均顯著降低了SMBC含量(圖1A)。在施氮肥處理7天和30天時,無論是單株還是3株種植,施肥后SMBN含量均顯著增加。處理時間越長,施肥與對照處理的SMBC和SMBN含量差異越大(圖1B)。

表3 施氮肥對馬尾松幼苗土壤微生物群落結構的影響(平均值±標準誤)(n=3)

施氮肥處理7天后,單株和3株種植的土壤微生物群落都有下降趨勢,其中3株種植革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、放線菌、真菌含量顯著降低,而單株種植及3株種植的叢枝菌根真菌差異不顯著。在施肥處理30天后,單株與3株種植土壤微生物群落總含量仍然比未施肥低,其中施肥后3株種植的土壤革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、放線菌、叢枝菌根真菌、真菌、真核菌含量均顯著降低(表3)。3株種植的土壤各種微生物均低于單株種植土壤,在施肥處理30天后,革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、放線菌、叢枝菌根真菌顯著降低。

2.4 土壤CO2、N2O釋放速率

圖2 施氮肥對土壤CO2和N2O釋放速率的影響(n=3) Fig.2 Effects of nitrogen fertilization on soil CO2 and N2O flux(n=3)

無論是單株還是3株種植,施肥1天后(6月23日)土壤CO2釋放速率出現(xiàn)峰值,施氮肥處理的土壤CO2釋放速率顯著高于未施肥處理。但隨處理時間的推移,施肥處理的土壤CO2釋放速率與對照差異不顯著。處理7天至11天(6月29—7月3日),單株對照和施肥處理CO2釋放速率均顯著高于3株。而處理3周后(7月14日),施肥處理的土壤CO2釋放量低于對照(圖2)。施氮肥處理后,顯著增加了1株與3株栽植的土壤N2O釋放速率,施氮肥處理的N2O氣體釋放峰值時顯著高于對照,隨土壤含水量降低,N2O釋放量也迅速下降(圖2)。無論是單株還是3株種植,施肥處理土壤CO2和N2O釋放的峰值出現(xiàn)的時間一致,均出現(xiàn)在澆水后一天。無論是施肥與不施肥處理,其CO2釋放速率波動趨勢一致,在峰值后有逐漸下降的趨勢,在澆水后又急劇回升。但單株和3株施肥處理的N2O釋放量在澆水后1天出現(xiàn)峰值,而后迅速降低;未施肥處理N2O釋放量對澆水的響應不明顯,在監(jiān)測期內(nèi)沒有顯著的波動(圖2B)。

2.5 土壤CO2、N2O釋放釋放的主要影響因素

相關分析表明,土壤CO2釋放速率與N2O釋放速率相關,土壤CO2釋放速率受SMBC、土壤溫度、pH值和硝態(tài)氮含量等因子的顯著影響;土壤N2O釋放速率主要影響因子有SMBC、SMBN、土壤濕度、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮含量。土壤CO2釋放速率與土壤溫度及硝態(tài)氮含量呈顯著負相關(P<0.05),與土壤SMBC和pH值呈極顯著正相關(P<0.01),土壤N2O釋放釋放速率與SMBN、土壤溫度及硝態(tài)氮顯著正相關,與土壤SMBC、銨態(tài)氮及pH值顯著負相關(表4)。SMBC與土壤溫度顯著負相關;而SMBN與土壤pH 值顯著負相關,與SMBN、土壤溫度、土壤硝態(tài)氮含量顯著正相關。根系生物量多少不僅顯著影響SMBN及土壤濕度,而且對土壤銨態(tài)氮含量也有顯著影響(表4)。逐步回歸分析表明,土壤硝態(tài)氮含量是影響CO2(R2=0.334)和N2O (R2=0.924)釋放的關鍵因子。

表4 土壤CO2和N2O釋放速率與土壤環(huán)境因子的相互關系

* 在 0.05 水平(雙側)上顯著相關,** 在 0.01 水平(雙側)上顯著相關,n=24

3 討論

3.1 施氮肥對SMBC、SMBN及微生物群落結構的影響

SMBC是土壤碳氮循環(huán)途徑的關鍵因子,其含量的變化是預測土壤肥力、土壤微生物活性以及土壤碳氮周轉速度的重要指標[22]。本研究模擬氮沉降顯著降低了SMBC含量,土壤氮含量顯著增加改變了土壤微環(huán)境,導致土壤C/N比降低,而較低的C/N有利于土壤有機碳的分解釋放,進而導致土壤有機碳的逐漸減少[23];土壤微生物的活性會隨著有機碳降低而減弱,也可能是導致SMBC含量降低的原因之一[24]。SMBN的變化是衡量土壤氮素循環(huán)周轉的關鍵性因子[25],本研究中施氮肥增加了土壤氮含量和SMBN含量。土壤氮含量的增加提高了土壤微生物氮循環(huán)所需的底物,導致微生物活性變強,因此可能是提高SMBN含量的主要原因。

施氮肥處理降低了土壤微生物群落結構總含量,特別是土壤中細菌的含量顯著下降,劉桂要[26]對油松(Pinustabulaeformis)林的研究結果也表明,添加氮處理對土壤細菌群落結構組成的影響程度大于真菌。施氮導致單株種植總微生物量下降13.3%,3株種植比單株種植下降更為顯著,下降了29.5%。這與Ramirez等[27]對北美洲28個生態(tài)系統(tǒng)中的土壤氮沉降使土壤微生物量下降35%的研究結果基本一致。適量的施氮肥可改善土壤理化性質(zhì)及微生物活性等,但氮施用過量則會造成土壤微生物多樣性降低[28- 29]。施氮肥后的土壤速效氮含量在41.36—126.68 mg/kg,超過植物正常需求(10—20 mg/kg),進一步表明過量施用氮肥會導致土壤微生物量下降。洪丕征等[30]模擬氮沉降對紅椎(CastanopsishystrixMiq.)人工幼林土壤影響的研究發(fā)現(xiàn),氮沉降導致土壤微生物下降的主要機制是土壤pH值的降低,因為土壤pH值過低會抑制細菌生長[31],這與本研究中土壤pH值與土壤SMBC顯著相關的結果也是一致的(表4)。增氮還會通過改變微生物對碳源的利用效率而對土壤微生物量產(chǎn)生影響,一般在高氮處理下,土壤微生物對碳源的利用能力降低[32-33]。氮對土壤微生物群落結構的影響機制是復雜的,需要綜合考慮土壤氮的增加量以及氮增加對土壤pH值、土壤C/N、土壤微生物碳源利用效率等的影響等。

3.2 施氮肥對土壤溫室氣體釋放的影響

模擬氮沉降短時間內(nèi)提高了土壤CO2的釋放速率,而后土壤CO2釋放與對照相比有降低趨勢或無顯著差異。這可能是因為在施肥后土壤C/N降低,加快了土壤CO2的釋放速率[34]。施肥提高了土壤中有效氮的含量,提高了土壤酶活性,為微生物生命活動提供充足的底物,從而在短時間內(nèi)達到促進土壤呼吸的作用,但這種促進作用會隨著時間的推移而漸減弱甚至消失[35- 36]。也有相關研究證明,長期的施氮肥減少了微生物的呼吸,從而降低CO2的釋放速率[35]。Liang等[37]對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的研究表明,施肥能夠提高土壤中根系的自養(yǎng)呼吸,且自養(yǎng)呼吸的響應快于異養(yǎng)呼吸。施肥后,根系呼吸快速反應而對提高CO2的釋放速率有一定貢獻,但隨時間推移,由于過量施肥處理的土壤微生物群落數(shù)量的顯著下降,導致土壤異養(yǎng)呼吸顯著下降,從而掩蓋了根系呼吸的貢獻量。

增施氮肥顯著提高了土壤N2O釋放速率,這與Jassal等[38]對森林土壤施氮肥后的研究結果一致。本研究中施氮肥后土壤硝態(tài)氮含量顯著增加,而且施肥降低了土壤SMBC含量,增加了土壤SMBN含量,土壤微生物群落總量顯著下降,這些因素的響應均與N2O釋放速率呈顯著相關。相關研究表明,增施氮肥也會通過降低土壤pH值,改變土壤的微生物活性,進而改變土壤的呼吸速率[39]。氮肥施入土壤后,經(jīng)礦化過程以硝酸鹽的形式存在于土壤中,增加了土壤硝化的底物[40];施肥后土壤C/N較低時,也可以降低反硝化微生物對氮素的競爭力,從而減緩土壤的反硝化過程[41-42],施肥后硝化底物的增加及反硝化過程的減緩是N2O釋放速率增加的重要原因。

相關性分析表明,與土壤CO2釋放速率相關的因子主要有SMBC、土壤溫度、土壤pH值及硝態(tài)氮含量,逐步回歸分析表明土壤硝態(tài)氮含量是土壤CO2釋放速率的決定性因子。土壤N2O釋放速率與SMBC、SMBN、土壤溫度、土壤濕度、pH值及土壤硝態(tài)氮含量均呈顯著相關,逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)土壤N2O釋放速率主要取決于硝態(tài)氮含量。在以往研究中,土壤溫度與土壤濕度是土壤CO2釋放速率的主要影響因素[43-44],劉順[45]對川西亞不同森林類型的研究結果表明,土壤呼吸和總硝化速率與土壤溫度顯著相關,而與土壤水分相關性不顯著。土壤水分是通過影響根和微生物活動、底物的擴散和土壤氧氣濃度等而直接和間接的影響土壤碳氮的轉化速率[46- 47],當土壤水分不是環(huán)境限制因子時,土壤溫度通常是影響土壤呼吸的重要影響因子[45]。而本研究中,雖然土壤溫度與CO2和N2O的釋放呈顯著正相關,土壤濕度與N2O的釋放顯著負相關,但逐步回歸分析表明影響CO2和N2O的釋放速率的決定性因子是土壤硝態(tài)氮含量。這些研究結果說明,在不同地區(qū)、不同森林類型及氣候條件下,林地土壤環(huán)境的復雜性及限制因子的不同,可能是溫室氣體釋放關鍵因素差異的原因。

3.3 根系生物量與土壤溫室氣體釋放的關系

無論是對照還是施肥處理,3株(根系生物量增加)栽植土壤中的速效氮含量均顯著降低(表2),可能是因根系對養(yǎng)分的吸收利用增加而減少了土壤中的氮含量,土壤N2O釋放速率因根系增加而顯著下降。另外,3株種植根系生物量高,對土壤水分的消耗也較單株高,因而顯著降低了土壤水分含量,土壤濕度的降低通過影響土壤溫度及SMBN,直接或間接地影響土壤溫室氣體的釋放速率。土壤溫室氣體釋放速率隨著隨根系生物量的增加而增加[16- 17],在未施肥處理條件下,根系生物量較高的3株處理其土壤微生物群落生物量也較高,也會對土壤溫室氣體產(chǎn)生一定的影響。

根系呼吸與根系氮濃度具有極大的相關性[48],施肥處理導致根系氮含量顯著增加,這在一定程度上可能會增加根系的呼吸速率[20]。但由于過量施肥顯著降低了土壤微生物群落結構,土壤微生物呼吸顯著下降[35],這在一定程度上掩蓋了根系生物量及根系氮濃度對土壤呼吸的貢獻量。