復(fù)方斯亞旦生發(fā)油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升△

馬建文，賈春燕，夏米西奴爾·艾買提江，馬娟，孟玲，王萍*

1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011

由《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊》(1998年)收錄的復(fù)方斯亞旦生發(fā)油是由黑種草子、桃仁、石榴子等常用維吾爾藥材組成的純天然制劑，具有溫膚生發(fā)、止癢祛屑之功[1]，廣泛用于養(yǎng)發(fā)、生發(fā)、斑禿等，且獲得良好的治療效果。但復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅僅只有性狀、鑒別、檢查三項，且鑒別項僅為化學(xué)顯色反應(yīng)，檢查項下僅僅只有相對密度和折光率兩項，難以全面評價和控制其質(zhì)量，因此有必要對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為更深入開發(fā)利用祖國民族醫(yī)藥提供依據(jù)，從而保證廣大人民群眾用藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 2996二極管陣列檢測器)；AL204電子天平、AG135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Direct-QTM超純水儀(Millipore)。

1.2 試藥

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油(新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號分別為：0150910、0151020、0160320、0160405、0160411、0160520、0160521、0160740、0160741、0160927)；苦杏仁苷對照品、常春藤皂苷元對照品、沒食子酸對照品、桃仁對照藥材、黑種草子對照藥材、石榴子對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110820-201506、111733-201205、110831-200302、120953-201407、121428-200502、121431-201002)；水為超純水；乙腈、甲醇為色譜純(美國Fisher Scientific公司)；薄層層析用硅膠G(青島海洋化工有限公司)；其他試劑均為分析純(新疆烏魯木齊市匯福源醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 桃仁的薄層色譜鑒別

取復(fù)方斯亞旦生發(fā)油5 mL，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另精密稱取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，得到對照品溶液。另按處方稱取缺桃仁的其他藥材，按制備工藝制備陰性樣品，照供試品溶液制備方法得到缺桃仁的陰性對照溶液。照《中華人民共和國藥典》2015年版四部0502薄層色譜法項下試驗，吸取供試品溶液15 μL，對照品溶液4 μL，陰性對照溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10C放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液為顯色劑，在105C加熱至斑點清晰[2-7]。結(jié)果在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色的斑點，而陰性對照溶液沒有出現(xiàn)相應(yīng)顏色的斑點。見圖1。

注：1.陰性對照；2.苦杏仁苷對照品；3～5.供試品。圖1 桃仁薄層色譜圖

2.2 檢查

取10批復(fù)方斯亞旦生發(fā)油樣品，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0713項下脂肪與脂肪油測定法有關(guān)的各項規(guī)定檢查[8]，見表1。

表1 復(fù)方斯亞旦生發(fā)油檢查項下測定結(jié)果

從上表可以看出，復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的酸值平均值為14.74，其最大值為15.36，最小值為14.32，根據(jù)10批樣品酸值測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品酸值應(yīng)不大于16。

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的皂化值平均值為251.94，其最大值為262.96，最小值為241.06，根據(jù)10批樣品皂化值測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品皂化值應(yīng)為226.7～277.1。

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的羥值平均值為30.10，其最大值為31.80，最小值為28.93，根據(jù)10批樣品羥值測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品羥值應(yīng)為27.1～33.1。

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的碘值平均值為90.27，其最大值為90.86，最小值為89.60，根據(jù)10批樣品碘值測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品碘值應(yīng)為81.2～99.3。

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的過氧化值平均值為9.05，其最大值為9.39，最小值為8.65，根據(jù)10批樣品過氧化值測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品過氧化值為8.14～9.96。

2.3 苦杏仁苷的HPLC含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：SYMMETRY C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(18∶82)，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL[7-8]。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密吸取苦杏仁苷對照品2.45 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解后，稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(苦杏仁苷質(zhì)量濃度為0.098 mg·mL-1)。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品適量，置于錐形瓶中，加入20 mL甲醇溶液，稱質(zhì)量，超聲處理1 h，冷卻后稱質(zhì)量并補足減失的質(zhì)量，過濾，濾液蒸干，再精密加甲醇5 mL使溶解，過濾，濾液再用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，照2.3.1項下測定，峰面積積分值經(jīng)2.3.6 項下線性回歸方程計算。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺苦杏仁的其余兩味藥材(按處方比例)，按其制備工藝制備得到陰性樣品，按2.3.3項下方法制備得到陰性對照樣品溶液。

2.3.5 專屬性試驗 精密吸取2.3.2、2.3.3、2.3.4項下溶液各10 μL，照2.3.1項下測定，結(jié)果見圖2。

結(jié)果與對照品色譜相比較，供試品色譜出現(xiàn)保留時間一致的色譜峰，而陰性對照沒有。表明本方法有良好的專屬性。

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3.2項下苦杏仁苷對照品儲備液各0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，置于5 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后，濾過，分別制成質(zhì)量濃度為0.009 8、0.019 6、0.029 4、0.039 2、0.049 0、0.058 8 mg·mL-1的系列對照溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：Y=10 434 985.43X-43 589.33，r=0.999 9。結(jié)果表明：在0.009 8～0.058 8 mg·mL-1峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果其RSD為0.85%(n=6)。

取同一對照品溶液，連續(xù)測定6 d，記錄峰面積值，結(jié)果其RSD值為0.56%(n=6)。

2.3.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品，照供試品溶液制備方法平行制得6份供試品溶液，分別測定苦杏仁苷的峰面積，結(jié)果其RSD為1.51%(n=6)，表明本試驗方法重復(fù)性良。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.為苦杏仁苷。圖2 苦杏仁苷高效液相色譜圖

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果其RSD為2.01%(n=6)。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取已經(jīng)測定過含量的同一批樣品6份，然后分別精密加入2.3.2項下對照品儲備液1 mL，按2.3.3項下方法制備，照2.3.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3.11 10批樣品含量測定 對采購得到的10批復(fù)方斯亞旦生發(fā)油采用上述方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果批號分別為0160411、0160405、0160927、0160320、0160521、0160520、0160741、0160740、0151020、0150910，其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.04、0.03、0.03、0.04、0.05、0.04、0.03、0.03、0.03、0.04 mg·g-1。結(jié)果10批樣品平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.036 mg·g-1，根據(jù)10批樣品含量測定結(jié)果、藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定本品每1 g含桃仁以苦杏仁苷(C20H27NO11)計，應(yīng)不得少于0.03 mg。

3 討論

在參考2015年版《中華人民共和國藥典》一部及大量文獻(xiàn)[2-8，9-12，15-16]的基礎(chǔ)上，本實驗對全方藥味分別進(jìn)行了TLC定性鑒別，分別采用多種不同的供試品處理方法及展開劑進(jìn)行實驗，結(jié)果復(fù)方斯亞旦生發(fā)油中主要成分—桃仁的薄層色譜斑點清晰，分離效果較好，具有重復(fù)性好、專屬性強、簡便、快速等特點，可作為該制劑的定性鑒別依據(jù)。

在黑種草子的薄層色譜鑒別研究中，曾采用《中華人民共和國藥典》含量測定項下的供試品溶液，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(6∶4∶0.25)為展開劑，結(jié)果色譜位置上并無明顯的斑點，故考慮更換處理方法，參考其他文獻(xiàn)[12-15]，以正丁醇-水-乙酸(4∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視，以苯-甲醇-甲酸(17∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果經(jīng)過多次實驗，色譜位置上均無明顯的斑點，故未將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

在參考2015版《中華人民共和國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]的基礎(chǔ)上，采用了多種供試品溶液的處理方法，并對多種色譜條件進(jìn)行研究，均未能得到黑種草子中的主要有效成分—常春藤皂苷元的HPLC測定方法，因此筆者認(rèn)為在復(fù)方斯亞旦生發(fā)油中存在大量的油脂類成分，而常春藤皂苷元等成分含量極低，因此未能檢測到。

在石榴子的薄層鑒別中，曾按《中華人民共和國藥典》方法石榴皮項下采用甲醇超聲提取制備樣品處理，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)展開劑，以1%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，結(jié)果色譜位置上并無明顯的斑點，參考其他文獻(xiàn)[15-16]，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶12∶3)為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(14∶6∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，立即檢視，結(jié)果色譜圖均無明顯的斑點。雖然采用了多種不同的處理方法對供試品溶液進(jìn)行處理，并采用了多種不同的展開系統(tǒng)進(jìn)行實驗，結(jié)果供試品色譜或不能很好的分離或者未見到相應(yīng)斑點出現(xiàn)，故未將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的制備方法是黑種草子、桃仁清炒后，立即與石榴子混合，用榨壓法取油，濾過，靜置，取上清液1000 mL，加防腐劑適量，分裝，即得[1]。根據(jù)其制備工藝，要求本品檢查項下應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》2015版(四部)搽劑項下的有關(guān)規(guī)定；另外本研究按《中華人民共和國藥典》2015版(四部)0713脂肪與脂肪油測定法項下對本品的酸值、皂化值、羥值、碘值、過氧化值進(jìn)行了檢驗，并根據(jù)10批樣品測定結(jié)果，結(jié)合藥材性質(zhì)、制劑生產(chǎn)及儲藏等條件，暫定了本品上述檢驗項目的限度。結(jié)果10批樣品的酸值、皂化值、羥值、碘值、過氧化值均在制訂的限度值范圍內(nèi)。

苦杏仁苷含量測定項下，在供試品溶液的制備過程中，為了保證樣品中苦杏仁苷充分提取，分別對不同提取方法(超聲30、45、60、75、90 min，加熱回流30、60、90 min)、不同種類的提取溶劑(乙醇、甲醇、水)、不同濃度的提取溶劑(20%、40%、60%、80%、100%甲醇)、溶劑加入倍量(2、4、6、8、10倍)進(jìn)行考察。結(jié)果本品用4倍量100%甲醇溶液作提取溶劑，超聲提取60 min，提取效果較好。

目前在我國只有新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)復(fù)方斯亞旦生發(fā)油，由于其治療效果得到了廣大患者的認(rèn)可，生產(chǎn)量比較大，是該廠家的主要產(chǎn)品之一。本研究結(jié)果表明，該廠家不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的整體一致性還是比較好的，但還存在一定差異。

采用高效液相色譜法測定了10批復(fù)方斯亞旦生發(fā)油中的苦杏仁苷的含量，并制訂了其限度值。因為復(fù)方斯亞旦生發(fā)油的制備工藝相對簡單，10批復(fù)方斯亞旦生發(fā)油質(zhì)量的差異，分析原因可能是產(chǎn)地不同、批次不同的中藥材原料的質(zhì)量不同而產(chǎn)生的影響，另外生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性可能也與之相關(guān)。因此在保證產(chǎn)品工藝一致性的情況下，一定要控制原藥材質(zhì)量的均一與穩(wěn)定。