簡化樣品處理快速測定酸棗仁中多種成分含量的研究△

周賽男，郭寶林

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子，別名棗仁，是我國傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)心補肝，寧心安神等功效，也是藥食同源物質(zhì)，主要用于改善睡眠。酸棗仁主要含有皂苷類和黃酮類化學成分，2015版《中華人民共和國藥典》[1]規(guī)定酸棗仁含量測定成分為皂苷類的酸棗仁皂苷A(jujuboside A)和黃酮類的斯皮諾素(spinosin)，在供試品溶液制備過程中，需要先用石油醚索氏提取4 h去掉油脂，然后加熱回流提取2 h，該方法也被大多數(shù)含量測定文獻采納[2-10]，但該方法較為繁瑣，耗時較長。

含有油脂的種子類藥材的成分分析，先脫脂后提取是傳統(tǒng)方法，傳統(tǒng)認為脂肪含量高時，可能影響目標成分的完全提取，且如果不脫脂，提取液中含有的脂肪可能會影響液相色譜柱的柱效。但經(jīng)查閱2015版《中華人民共和國藥典》中富含油脂類種子藥材共有47種，僅有13種采用了先脫脂后提取的工藝，表明該方法不是普遍方法，更值得關(guān)注的是，同樣測苦杏仁苷含量的桃仁和杏仁兩個藥材，樣品前處理桃仁是先石油醚加熱回流1 h脫脂，后70%甲醇加熱回流1 h提取，而苦杏仁則直接用甲醇超聲處理30 min，說明脫脂過程可能是非必須的。本研究組一直從事酸棗仁的種質(zhì)資源評價和品種優(yōu)選工作，為滿足大量的樣品快速測定，建立了一種不脫脂的樣品前處理方法，測定其中的皂苷和黃酮兩類成分含量。

1 實驗樣品、試劑及儀器

1.1 實驗樣品

酸棗仁樣品購自河北安國，產(chǎn)地為甘肅，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子。

1.2 藥品及試劑

對照品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于98%。

乙腈(色譜純)購于美國Fisher公司；蒸餾水購于杭州娃哈哈集團有限公司；其他溶劑均為分析純。

1.3 主要儀器

ACQUITY UPLC(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、ELS檢測器、TUV檢測器、Empower色譜工作站)(美國Waters公司)，AT261DeltaRange+w十萬分之一天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)，F(xiàn)A210N電子天平(上饒市鴻翔實業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取4種對照品適量于5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，得斯皮諾素2.110 mg·mL-1、6?-阿魏酰斯皮諾素1.950 mg·mL-1、酸棗仁皂苷A 2.176 mg·mL-1、酸棗仁皂苷B 1.004 mg·mL-1的對照品儲備液，并各取1 mL置5 mL的容量瓶中，定容，即得混合對照品儲備液。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY C18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈(A)-水(0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～4 min，14.5%～16%A；4～5 min，16%～20% A；5～9 min，20% A；9～11 min，20%～37% A；11～17 min，37% A；17～19 min，37%～100% A；19～22 min，100% A；22～24 min，100%～14.5% A；24～27 min，14.5% A)；體積流量0.3 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量3 μL；TUV檢測波長：335 nm；ELSD條件漂移管溫度60 ℃，氣壓25 psi。色譜圖如下圖1。

注：1.斯皮諾素；2.6?-阿魏酰斯皮諾素；3.酸棗仁皂苷A；4.酸棗仁皂苷B；A.對照品UV色譜圖；B：樣品UV色譜圖；C：對照品ELSD色譜圖；D：樣品ELSD色譜圖。圖1 酸棗仁4種成分的UPLC色譜圖

2.3 酸棗仁樣品前處理快速方法的建立

2.3.1 幾種提取方法和《中華人民共和國藥典》樣品處理方法的比較 《中華人民共和國藥典》方法(以下簡稱藥典方法)：取本品粉末約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，加熱回流2 h，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

直接回流法：取本品粉末約1 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入70%乙醇30 mL，加熱回流(時間又分為10、20、30、40、60和120 min)，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

超聲提取法：取本品粉末約1 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，常溫超聲(超聲時間又分為30、60和90 min)，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

共10種不同的處理方法，各3個重復，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B 4種成分的峰面積結(jié)果見圖2。

從圖2各個處理4個成分的峰面積及顯著性差異分析結(jié)果可以看出，幾種加熱回流方法中，黃酮類的斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素加熱回流10～30 min峰面積呈上升趨勢，30～120 min呈下降趨勢，加熱回流30 min組高于與其他各回流組，且均有顯著性差異(6?-阿魏酰斯皮諾素的30 min組和40 min組無顯著差異)；皂苷類成分酸棗仁皂苷A加熱回流10～40 min呈上升趨勢，40～120 min略有下降，回流40 min組高于其他組，與10～30 min各組有顯著差異，而與60、120 min組無顯著性差異；酸棗仁皂苷B加熱回流10～60 min峰面積呈上升趨勢，回流120 min時峰面積略有下降，回流60 min組高于其他組，且均有顯著差異。因此兩類成分均表現(xiàn)為加熱回流時間過長有含量降低的趨勢(可能發(fā)生了降解)，但是黃酮類成分降低幅度較大，綜合考慮兩類成分，加熱回流30 min為最佳的回流方法。

圖2 10種前處理方法結(jié)果(n=3)

幾種超聲方法中，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素和酸棗仁皂苷A均表現(xiàn)超聲30～90 min峰面積呈上升趨勢，超聲90 min的峰面積最高，且均與30 min有顯著差異，斯皮諾素則與超聲60 min也有顯著差異。酸棗仁皂苷B則60 min的峰面積最高，與超聲30 min有顯著差異，但是與超聲90 min沒有顯著差異，綜合考慮兩種成分，超聲90 min為最佳超聲方法。

藥典方法的結(jié)果，除了酸棗仁皂苷B外，均顯著低于回流30 min的提取方法，也顯著低于回流時間120 min的提取方法，說明藥典方法中較長的回流時間會導致成分降解，特別是黃酮類，是不合適的，且脫脂的過程也使得一些成分丟失。超聲90 min的方法在皂苷類成分提取效果上和回流30 min無顯著差異，但黃酮類成分略低于回流的提取率，斯皮諾素低2.6%，6?-阿魏酰斯皮諾素低4.0%。但因超聲方法便利，且對于熱敏感的黃酮類成分更容易控制，因此本文推薦用超聲90 min的處理方法。

在超聲提取法中，又考察了提取溶劑(甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇)、提取物料比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40)對待測成分提取率的影響。最終優(yōu)化的提取條件為70%乙醇作為提取溶劑，物料比1∶30。

2.4 超聲提取法的方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取混合對照品儲備液2.5 mL置5 mL的容量瓶中，定容，逐級稀釋，即得各系列的混合標準品溶液。按照2.3項下條件進樣3 μL，其中斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素以UV檢測峰面積(Y)對對照品濃度(X，mg·L-1)進行線性回歸，酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B以ELSD檢測峰面積的對數(shù)(Y)和對照品濃度的對數(shù)(X)進行線性回歸，得各對照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍(表1)。

表1 酸棗仁中4個化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液按2.3項下色譜條件，于1 d內(nèi)連續(xù)進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對照品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B日內(nèi)峰面積RSD分別為1.73%、1.89%、2.74%、2.94%；連續(xù)3 d內(nèi)每天連續(xù)進樣6次，測得日間峰面積RSD分別為2.54%、2.78%、3.15%、3.03%。

2.4.3 重復性試驗 取樣品粉末6份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜方法測定，計算斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD分別為2.35%、2.05%、2.75%、3.32%，結(jié)果表示實驗的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定。計算斯皮諾素，6?-阿魏酰斯皮諾素，酸棗仁皂苷A，酸棗仁皂苷B 含量的RSD分別為2.43%、2.25%、2.83%、3.02%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實驗

取已知含量的供試品粉末(WS-15)9份，每份各約0.5 g，精密稱定，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入各標準品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B，按照2.1項下方法平行制備，2.3項下色譜方法測定，測得四種化合物的平均回收率見表2，結(jié)果表明該方法的準確性較好。

表2 酸棗仁中4個成分的加樣回收率(n=3)

3 討論

本文為了簡化酸棗仁含量測定的方法，在樣品前處理過程中考察了簡單超聲提取法、直接加熱回流法和脫脂后加熱回流提取法(藥典方法)，通過比較斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B等4種成分的峰面積發(fā)現(xiàn)，加熱回流30 min是最佳方法，但超聲90 min的效果與之相差較小，且易于操作，因此推薦超聲90 min的方法。經(jīng)過方法學驗證，該方法快速、準確，為控制酸棗仁中黃酮類成分和皂苷類成含量的快速測定提供了可靠的方法。

本文的比較研究結(jié)果表明藥典方法測定的兩類成分偏低，使用本文提供的超聲方法，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B等4種成分測得含量值分別比藥典方法高14.4%、10.8%、23.2%、2.2%。