右美托咪啶復(fù)合帕瑞昔布對膽總管結(jié)扎大鼠術(shù)后血管新生相關(guān)因子表達的影響*

楊明友，張 超，張 銘，魯開智

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科(重慶 400038)

肝肺綜合征(Hepatopulmonary syndrome, HPS)病死率高、防治困難，近年報道發(fā)現(xiàn)病理性肺血管新生在HPS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。同時動物實驗也證實VEGF、SDF-1以及CX3CL1等血管新生相關(guān)因子在HPS大鼠外周血和肺組織中表達增高，這些因子一方面可通過直接作用于微血管內(nèi)皮細胞促進其增殖，另一方面可以通過募集干細胞及單核細胞間接的促進HPS大鼠肺病理性血管新生[2-4]。右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗交感和鎮(zhèn)痛的藥理作用，可減輕手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)并且可抑制促炎細胞因子的釋放，具有一定的器官保護作用[5]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)術(shù)中持續(xù)給予右美托咪定能夠顯著降低肝門阻斷患者圍手術(shù)期血漿SDF-1的表達水平[6]。由于環(huán)氧化酶-2(COX-2)在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，并且研究發(fā)現(xiàn)COX-2的激活明顯促進了膽總管結(jié)扎(CBDL)大鼠巨噬細胞聚集以及炎癥性血管新生[4]。為此，本研究擬通過建立HPS動物模型，術(shù)后應(yīng)用右美托咪啶復(fù)合COX-2抑制劑帕瑞昔布并對比單純應(yīng)用右美托咪啶的效果，檢測不同時間點血漿和肺組織中VEGF、SDF-1以及CX3CL1等血管新生相關(guān)因子的表達變化以及術(shù)后3周動脈血氧合的改善情況，為進一步研究肝肺綜合征患者的臨床治療方案提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠，體重(200～220)g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動物室，飼養(yǎng)在有燈光控制分12 h白晝變換的房間，自由飲水和進食標(biāo)準食物。實驗前至少1周在該房間適應(yīng)環(huán)境。

2 實驗分組及梗阻性黃疸模型的建立 將實驗動物分為四組，每組24只：Sham手術(shù)組(S組)、CBDL手術(shù)組(C組)、CBDL+右美托咪啶組(D組)、CBDL+右美托咪啶復(fù)合帕瑞昔布組(DP組)，四組均以術(shù)后7、14 d 和21 d三個時相點分為三個亞組，每組樣本數(shù)為8只。在實驗之前，大鼠禁食12 h，僅給自由飲水。麻醉方法：腹腔注射5% 水合氯醛麻醉(0.08 ml/kg)。CBDL大鼠手術(shù)方法：沿上腹正中線切開皮膚，剪開皮下組織、腹膜進腹；沿肝十二指腸韌帶尋找膽總管，于胰腺上方近十二指腸處游離膽總管，雙重結(jié)扎，并于兩結(jié)扎線之間切斷；連續(xù)縫合腹膜、皮下組織、皮膚、關(guān)腹；待復(fù)溫至動物蘇醒后，移入動物房，術(shù)后動物自由飲食。具體給藥方式如下(術(shù)后第1天開始)：D組每日尾靜脈注射10 μg/kg右美托咪啶；DP組每日靜脈注射10 μg/kg右美托咪啶+10 mg/kg帕瑞昔布；C組和S組每日靜脈注射等量生理鹽水。S組手術(shù)方法：僅行一個簡單的剖腹手術(shù)，分離但總管但并不結(jié)扎，然后在7、14、21 d處死動物取血漿、肺，保存于-80℃待測。

3 組織勻漿 取組織塊(0.2～1 g)，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5 ml的小燒杯內(nèi)，然后用移液管量取0.86%冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量是組織塊重量的9倍，用移液管或移液器取總量的2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中，眼科小剪盡快剪碎組織塊。將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)10次(6～8 min)，充分研碎，使組織勻漿化。勻漿的組織以3000 r/min離心10 min，取上清液待測。

4 VEGF、SDF-1、CX3CL1檢測 獲取各組大鼠血漿以及按上述方法得到的勻漿肺組織上清液后；采用ELISA法按照試劑盒說明書檢測各組不同時間點血漿以及肺組織中VEGF、SDF-1和CX3CL1的表達水平。

5 動脈血氣分析 從大鼠腹主動脈抽取動脈血并使用ABL 700血氣分析儀進行血氣分析。

6 肺組織HE染色 取大鼠左肺下葉，用PBS將殘留血液漂洗干凈，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h、制成石蠟切片并進行HE染色后，在光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用成組t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 四組各時間點血漿和肺組織VEGF、SDF-1和CX3CL1表達變化 與S組相比，C組血漿和肺組織SDF-1以及CX3CL1在各個時間點的表達均明顯升高，而VEGF僅在術(shù)后21 d高于S組。C組和D組相比，血漿和肺組織中各時間點VEGF和CX3CL1的表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，其中SDF-1的表達僅在術(shù)后7 d有差異。而DP組與C組相比，術(shù)后各時間點血漿及肺組織VEGF、SDF-1和CX3CL1表達均明顯降低(P<0.05)。見表1～3。

表1 四組各時間點血漿和肺組織VEGF表達水平 (pg/ml)

注：與S組同時間點比較，*P<0.05；與C組同時間點比較，△P<0.05

表2 四組各時間點血漿和肺組織SDF-1表達水平 (ng/ml )

注：與S組同時間點比較，*P<0.05；與C組同時間點比較，△P<0.05

表3 四組各時間點血漿和肺組織CX3CL1表達水平 (ng/ml)

注：與S組同時間點比較，*P<0.05；與C組同時間點比較，△P<0.05

2 術(shù)后21 d各組血氣分析結(jié)果變化 動脈血氣分析結(jié)果顯示：C組大鼠動脈血氧分壓(PO2)明顯低于S組大鼠而二氧化碳分壓(PCO2)沒有明顯差異；同時，C組的動靜脈血氧分壓差(AaPO2)與S組相比明顯升高。D組血氣結(jié)果各項指標(biāo)變化不大，與C組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而DP組的動脈氧分壓(PO2)和動靜脈氧分壓差(AaPO2)指標(biāo)均明顯好轉(zhuǎn)。見表4。

表4 術(shù)后21 d各組血氣分析結(jié)果變化 (mmHg )

注：與S組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05

3 術(shù)后21 d各組大鼠肺組織HE染色 肺組織HE染色結(jié)果顯示：與S組相比，C組大鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺間質(zhì)增厚；同時肺微血管擴張、數(shù)量增多。D組與C組相比病理表現(xiàn)沒用明顯改善，而DP組的炎性細胞浸潤與血管增生水平均明顯降低(圖1)。

圖1 各組肺組織HE染色結(jié)果 (200×)

討 論

肝肺綜合征是慢性肝病的嚴重肺部并發(fā)癥，最近的研究表明，病理性血管新生和增殖性損傷在CBDL大鼠肝損傷和肺損傷中起到關(guān)鍵作用，在一定程度上也促進了肝肺綜合征的發(fā)生發(fā)展[7]。而肺血管新生是一個多細胞參與的復(fù)雜過程，主要包括肺微血管內(nèi)皮細胞(Pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)的異常增殖、干細胞歸巢嵌入和單核細胞聚集炎性血管新生等[8]。研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4趨化信號軸在介導(dǎo)c-kit+細胞參與HPS肺血管新生中起到重要的作用，該研究顯示SDF-1在HPS大鼠肺組織中的表達明顯增多，并通過激活下游信號促進c-kit+細胞遷移到肺微血管，同時促進其旁分泌VEGF功能增強[2]。同時，F(xiàn)allon等人的研究團隊發(fā)現(xiàn)CX3CL1可趨化單核細胞在肺內(nèi)聚集，最后通過促進VEGF的表達從而促進HPS動物模型后期肺微血管的炎性增生[9]。以上研究提示VEGF、SDF-1以及CX3CL1均在HPS動物模型肺血管新生中起到重要作用，因此針對這些血管新生因子進行調(diào)控可控制HPS血管新生進程從而對HPS起到治療作用。

在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)術(shù)中持續(xù)給予右美托咪定能夠顯著降低肝門阻斷患者圍手術(shù)期血漿SDF-1的表達水平[6]。同時，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2抑制劑帕瑞昔布鈉可以有效抑制HPS大鼠肺炎性血管新生[4]。因此在本次研究中，我們通過對比單獨應(yīng)用右美托咪定和右美托咪定復(fù)合帕瑞昔布鈉對HPS大鼠血管新生相關(guān)因子的表達以及氧合功能的影響，進而探索針對HPS可能的治療策略。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CBDL組大鼠各時間點血漿和肺組織中SDF-1和CX3CL1的表達水平明顯高于Sham組，而VEGF則僅在術(shù)后21 d增高明顯。單獨給予右美托咪啶處理僅對早期SDF-1的表達具有抑制作用，而對CX3CL1以及后期VEGF和SDF-1的表達均無明顯影響；聯(lián)合應(yīng)用右美托咪啶和帕瑞昔布鈉后，CBDL組大鼠不同時間點各細胞因子的表達均明顯下降，提示右美托咪啶和帕瑞昔布鈉通過各自不同的機制對HPS大鼠各階段的血管新生因子的表達產(chǎn)生抑制作用。在CBDL的早期階段，肝臟和遠端器官可能被增多的膽紅素、內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)所損傷。而在晚期階段肝臟急性損傷逐漸代償、形成慢性肝硬化的改變，并最終導(dǎo)致肺部病變引起頑固性低氧血癥[10-11]。因此我們推測，早期CBDL大鼠主要是急性損傷引起的趨化因子SDF-1和CX3CL1表達的增高，而在疾病晚期持續(xù)性的缺氧和炎癥則成為各趨化因子表達增高的主要原因，并最終通過相關(guān)細胞的聚集引起VEGF的表達增高。右美托咪啶可通過激活α2腎上腺素能受體以及增強迷走神經(jīng)興奮性從而發(fā)揮抗炎及抗交感作用[12-13]，單獨應(yīng)用右美托咪啶僅對HPS大鼠早期SFD-1的表達增高具有抑制作用，表明右美托咪啶主要可能通過對HPS大鼠早期急性損傷抗交感作用來抑制SDF-1的表達，該結(jié)果也表明早期SDF-1與CX3CL1的表達增多機制不同。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用右美托咪定和帕瑞昔布鈉后，帕瑞昔布鈉通過抑制環(huán)氧化酶2發(fā)揮持續(xù)性抗炎作用從而抑制疾病后期SDF-1、CX3CL1以及VEGF的表達，從而改善HPS的癥狀。

綜上所述，右美托咪啶復(fù)合帕瑞昔布鈉對實驗性HPS大鼠模型血管新生相關(guān)因子SDF-1、CX3CL1以及VEGF的表達具有明顯的抑制作用，能有效改善HPS大鼠氧合狀態(tài)。而右美托咪啶和帕瑞昔布鈉作為臨床上常用的兩種藥物，具有重要的臨床價值，該結(jié)果對進一步臨床探索HPS的治療手段具有參考意義。