胃腺癌組織中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)及臨床意義

胡乃軍,王海龍

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科(錦州 121001)

胃癌是胃黏膜呈腺樣分化的一種惡性上皮性腫瘤，病變發(fā)生最常見(jiàn)的部位是遠(yuǎn)端胃，即胃竇及幽門(mén)區(qū)，胃體部腫瘤主要是大彎側(cè)及小彎側(cè)[1]。胃腺癌常伴有淋巴道轉(zhuǎn)移，一般預(yù)后較差，與病變形成時(shí)的浸潤(rùn)及播散有關(guān)[2]。近年研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞播散時(shí)可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白[3]。MMPs家族是與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分形成降解，破壞腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，腫瘤細(xì)胞易于離開(kāi)原發(fā)灶，形成播散。基質(zhì)金屬蛋白酶-11(MMP-11)和基質(zhì)金屬蛋白酶-12(MMP-12)是近年發(fā)現(xiàn)的與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白，兩者可能與脈管生成相關(guān)[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D(VEGF-D)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族的新成員，被認(rèn)為是淋巴管生成的促進(jìn)因子，通過(guò)其受體VEGFR3促進(jìn)間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并介導(dǎo)淋巴管新生[5]。2012年9月至2014年8月我們對(duì)胃腺癌術(shù)后組織應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)，分析其相關(guān)性及對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值。

資料和方法

1 一般資料 納入研究組的患者均為2012年9月至2014年8月在我院就診并手術(shù)治療的患者，共130例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①?lài)?yán)格按WHO中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診并分型；②均為原發(fā)且首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其它器官惡性腫瘤；②有消化道手術(shù)史者?；颊吣挲g51～85歲，中位年齡59歲；男69例，女61例。其中高分化23例，中分化20例，低分化87例；Lauren分型中腸型45例，彌漫型85例。選擇上述患者中距腫物邊緣大于3 cm的35例非腫瘤性胃黏膜組織作為對(duì)照組，年齡55～80歲，中位年齡60歲，男18例，女17例。

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組術(shù)后新鮮標(biāo)本中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)。新鮮標(biāo)本立即取材后應(yīng)用75%酒精固定24 h以上，用剪刀將組織剪成漿糊狀，進(jìn)行過(guò)濾，去除雜質(zhì)后離心(2000 r/min，10 min)，取沉淀物，制備單細(xì)胞懸液(1×106/ml)，取1 ml，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟依條件加一抗、PBS和二抗后，應(yīng)用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用系統(tǒng)自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果判定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用熒光指數(shù)(FI)表示，F(xiàn)I的計(jì)算方法：FI=蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，依據(jù)條件對(duì)數(shù)據(jù)行卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析、生存分析和線(xiàn)性相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D表達(dá)的比較 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在兩組中的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表1。

表1 兩組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的比較(FI值)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在研究組不同臨床及病理特征分組中的比較 研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)與脈管浸潤(rùn)、Lauren分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，MMP-11、MMP-12的表達(dá)與細(xì)胞的增殖指數(shù)相關(guān)。三者與分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表1 MP-11、MMP-12和VEGF-D在研究組不同臨床及病理特征分組中的比較

3 MP-11、MMP-12和VEGF-D表達(dá)的相關(guān)性分析 用線(xiàn)性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MMP-11和VEGF-D(r=0.39，P=0.0313)、MMP-12和VEGF-D(r=0.43，P=0.0213)具有正相關(guān)性。

4 MP-11、MMP-12和VEGF-D表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系 研究組患者隨訪生存時(shí)間8～60個(gè)月，平均23.4個(gè)月，經(jīng)生存分析顯示MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)(P<0.05)。即MMP-11、MMP-12和VEGF-D高表達(dá)患者生存時(shí)間短，預(yù)后差；MMP-11、MMP-12和VEGF-D低表達(dá)患者生存時(shí)間長(zhǎng)，預(yù)后好。

討 論

與胃腺癌發(fā)生有關(guān)的因素包括社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況低下、高鹽飲食等，其次胃癌的各種基因譜系如癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的異常改變也有關(guān)，再次與家族遺傳傾向也有明顯關(guān)聯(lián)[6]。有觀點(diǎn)認(rèn)為幽門(mén)螺桿菌感染在胃癌發(fā)生的早期階段可以起到重要作用[7]。分子生物學(xué)和免疫化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胃腫瘤形成和進(jìn)展有中可以有多種蛋白和基因表達(dá)失常，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、體細(xì)胞突變、APC、CyclinE、E-cadherin和nm23等表達(dá)異常等。近年流行病學(xué)結(jié)果顯示腸型胃癌的發(fā)生率逐年下降，而彌漫型腫瘤卻不斷增加，這可能與胃鏡的廣泛應(yīng)用及時(shí)檢出早期胃腺癌，使患者進(jìn)行治療減少了浸潤(rùn)性胃癌的發(fā)生率有關(guān)，也可能與彌漫型胃腫瘤在胃鏡進(jìn)行組織活檢時(shí)易漏診有關(guān)。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因異常表達(dá)是進(jìn)展期胃腺癌中的分子病理因素[8]。進(jìn)展期胃腺癌表現(xiàn)為息肉型、蕈傘形、潰瘍型或彌漫型。腫瘤鏡下形態(tài)主要由腺管狀、腺泡狀或乳頭狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，也可以表現(xiàn)為不相粘著的單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成(彌漫狀分布)，腫瘤細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)或隱匿在胃壁的各層，上皮細(xì)胞的異型性明顯，伴有不同程度的分化。MMP-11和MMP-12是分泌家族轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMPs家族中的兩個(gè)重要成員，具有高度保守的鋅離子依賴(lài)蛋白水解酶[9]。MMP-11主要是經(jīng)過(guò)細(xì)胞外的水解后活化，以活性酶的形式存在，能對(duì)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)的纖維和基質(zhì)的改建起一定的作用[10]。有研究認(rèn)為MMP-11能調(diào)節(jié)血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)間質(zhì)的淋巴細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞反應(yīng)[11]。MMP-12是由活化的炎細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞分泌，白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及血小板活化因子等均可以介導(dǎo)MMP-12的表達(dá)，而MMP-12在正常組織中不表達(dá)[12]。MMP-12有廣泛的底物活性，能分解彈性蛋白、IV型原和層粘連蛋白，并對(duì)腫瘤間質(zhì)的纖維組織有明顯的降解作用[13]。研究顯示MMP-12可以對(duì)肺纖維化和肺損傷組織的異常重建有明顯的促進(jìn)作用[14]。VEGF-D是新發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成促進(jìn)因子，在高遷移腫瘤的進(jìn)展時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的VEGF-D，引起間質(zhì)中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，新形成的脈管呈枝芽狀生長(zhǎng)，在物理性條件作用下，在新生腫瘤的間質(zhì)處形成管腔，與原淋巴管連接，具有脈管的播散功能，也為腫瘤細(xì)胞遷移提供了原始通道[15-16]。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)組織中蛋白的表達(dá)，結(jié)果可進(jìn)行半定量分析，客觀、可信，說(shuō)服力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示三者具有癌基因樣的作用，MMP-11、MMP-12和VEGF-D是腫瘤形成和進(jìn)展中的重要促進(jìn)蛋白。研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)與脈管浸潤(rùn)、Lauren分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示三者是與腫瘤遷移和播散相關(guān)的重要蛋白。MMP-11和MMP-12的表達(dá)與細(xì)胞的增殖指數(shù)相關(guān)，提示二者具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生和繁殖的作用。由于以上因素均為與患者生存時(shí)間(預(yù)后)相關(guān)的臨床及病理指標(biāo)，因此三者高表達(dá)可能與患者的生存時(shí)間或預(yù)后相關(guān)，而預(yù)后分析直接證實(shí)了此結(jié)論。研究組中MMP-11和VEGF-D、MMP-12和VEGF-D的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示MMP-11和MMP-12均可以促進(jìn)VEGF-D的表達(dá)[17]，誘導(dǎo)淋巴管生成。但是MMP-11和MMP-12在血管生成調(diào)節(jié)過(guò)程中的通路作用可能不確切。MMP-11、MMP-12在腫瘤進(jìn)展期中的表達(dá)升高，即隨著腫瘤進(jìn)展MMP-11和MMP-12分泌增加，引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞異型性明顯，增殖活躍，并能對(duì)P53和ras等基因進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和播散[18-19]。MMP-12具有多種生物學(xué)功能，通過(guò)識(shí)別ECM及細(xì)胞膜上免疫蛋白超家族粘附分子、細(xì)胞間粘附分子等介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附作用，并引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常及調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和增殖[20-21]。MMP-11在腺上皮惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中還可能通過(guò)對(duì)WNT和PI3K的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)起作用，由于MMP-11本身是一種分泌蛋白，其產(chǎn)生后不僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，還可以分泌到細(xì)胞外液體環(huán)境中，即在血液和組織液中可以檢測(cè)MMP-11的表達(dá)，因此血清中可以檢測(cè)出MMP-11的表達(dá)，其與組織中的表達(dá)可能有一定的一致性[22]。VEGF-D被認(rèn)為可能與MMP-11和MMP-12有協(xié)同作用的因子，MMP-11和MMP-12可能是上游基因，調(diào)節(jié)著VEGF-D/VEGFR3等信號(hào)通路，引起細(xì)胞增殖和遷移，但是它們是否能作為淋巴管生成的直接通路有待更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

總之，MMP-11、MMP-12和VEGF-D在胃腺癌中的表達(dá)上調(diào)，且具有正相關(guān)性，三者對(duì)病變的形成和進(jìn)展意義明顯，聯(lián)合檢測(cè)三者的表達(dá)對(duì)判斷預(yù)后可能有一定價(jià)值。