閆顏 汪茜 秦寶麗
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,遼寧 沈陽(yáng) 110042)
作為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,結(jié)直腸癌是第三常見(jiàn)的導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的疾病[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一大類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA轉(zhuǎn)錄物。lncRNAs在包括炎癥、動(dòng)脈硬化、自身免疫性疾病、腫瘤等多種疾病中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[2-3]。文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道,包括分化拮抗非編碼RNA(DANCR),肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1),漿細(xì)胞瘤易位變體1(PVT1),非活性X特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活(ATB)等多個(gè)lncRNAs均參與到結(jié)直腸癌的包括增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等多種病理學(xué)過(guò)程中。目前關(guān)于長(zhǎng)基因間非編碼RNA 483(LINC00483)在結(jié)直腸癌中表達(dá)及作用的報(bào)道極少。本研究將初步探討LINC00483在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)并研究其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
1.1材料 收集3例2018年1月至2018年2月期間行結(jié)腸癌切除術(shù)中切取的新鮮結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本,所有標(biāo)本于切除后立即用液氮保存運(yùn)送并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè);同時(shí)收集67例2015年1月至2018年1月期間行結(jié)腸癌切除術(shù)患者的福爾馬林固定并石蠟包埋的(FFPE)結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本?;颊呔?jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)診斷為結(jié)腸癌和或直腸癌?;颊吣?8例,女32例,年齡51~75歲,平均年齡64.3歲,所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。細(xì)胞系:人正常腸上皮細(xì)胞系NCM460和人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。
1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;青霉素、鏈霉素購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司;TRIzol及Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;QIAGEN FFPE RNeasy試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;特異性LINC00483探針、特異性LINC00483干擾寡核苷酸(siLINC00483-01和siLINC00483-02)及錯(cuò)義對(duì)照寡核苷酸(siscramble,siSCR)均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成;免疫原位雜交試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioChain公司;引物由上海生工生物工程公司合成。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人正常腸上皮細(xì)胞株NCM460及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29和LOVO均接種于添加10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,取生長(zhǎng)狀態(tài)佳的HT29和LOVO細(xì)胞調(diào)整密度為2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中,24 h后,利用Lipofectamine2000將siSCR及siLINC00483-01或siLINC00483-02分別轉(zhuǎn)染至HT29和LOVO細(xì)胞中,具體操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。48 h后進(jìn)行后續(xù)的qRT-PCR和transwell實(shí)驗(yàn)。
1.3.2qRT-PCR檢測(cè)LINC00483的表達(dá) 參照Trizol說(shuō)明書(shū)提取組織及細(xì)胞的總RNA并分組標(biāo)記;參照FFPE試劑盒說(shuō)明書(shū)提取石蠟包埋的結(jié)腸癌及癌旁組織標(biāo)本的總RNA。取5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成cDNA,反應(yīng)產(chǎn)物按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,設(shè)定GAPDH作為內(nèi)參,具體反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共45個(gè)循環(huán)。引物序列如下:LINC00483上游,5’-GCTGAACCGGAACAGGACAT -3’,LINC00483下游5’-CCAGTTCACAGCAACTCACG-3’;GAPDH上游 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’,GAPDH下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00483的表達(dá)并分別與各自的對(duì)照組(Paratumor組、NCM460組及siSCR組)比較并計(jì)算LINC00483的相對(duì)表達(dá)量。
1.3.3免疫原位雜交檢測(cè)LINC00483表達(dá)[7]將新鮮的結(jié)腸癌組織切片置于0.5% Triton X-100的1×PBS清洗液中清洗透膜,并置入含有1% 封閉液及LINC00483特異性探針的雜交液的濕盒中,將濕盒置入37 ℃孵箱中孵育過(guò)夜。次日分別用含有4×、2×及1×的0.1% Tween-20的檸檬酸鈉緩沖溶液依次清洗切片3次,5 min/次。室溫PBS清洗3次,DAPI復(fù)染,光學(xué)顯微鏡觀察。
1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT29及LOVO細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[7]常規(guī)包被底部膜,水化,對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn),采用Matrigel凝膠包被上室基膜。將分別轉(zhuǎn)染siSCR和siLINC00483-01/siLINC00483-02 48 h的HT29和LOVO細(xì)胞接種于Transwell上室內(nèi),接種密度為5×104個(gè)/孔。在上室內(nèi)加入100 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,下室內(nèi)加入500 μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,并置于37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育。48 h后取出Transwell小室,棉簽拭去Transwell小室內(nèi)部細(xì)胞,沖洗、固定、染色后倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組鋪6個(gè)Transwell 小室,取其平均值。
2.1LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高 3例新鮮的結(jié)腸癌及癌旁組織采用免疫原位雜交檢測(cè)LINC00483的表達(dá),見(jiàn)圖1a,相比于癌旁組織,LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯增高(***P<0.01);同時(shí),采用qRT-PCR法檢測(cè)了LINC00483在70例結(jié)腸癌標(biāo)本中的表達(dá)情況。見(jiàn)圖1b,相比于癌旁組織,LINC00483在絕大部分(94.29%,66/70)結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織。
注:***P< 0.01。
圖1LINC00483在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高
2.2LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)增高 結(jié)果顯示,與組織學(xué)水平的檢測(cè)結(jié)果相類(lèi)似,相比于人腸正常上皮細(xì)胞系NCM460,LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO的表達(dá)明顯增高(***P<0.01),見(jiàn)圖2。
注:***P< 0.01。
圖2qRT-PCR法檢測(cè) LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常腸上皮細(xì)胞系NCM460中的表達(dá)
2.3轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483的表達(dá) 見(jiàn)圖3,相比于轉(zhuǎn)染scramble siRNA(siSCR)組,轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后,LINC00483在HT29及LOVO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均受到了明顯抑制(**P< 0.01)。
注:**P< 0.01。
圖3轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)
2.4下調(diào)LINC00483可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)LINC00483對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。見(jiàn)圖4,下調(diào)LINC00483明顯削弱了HT29及LOVO細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(**P<0.01)。
圖4 下調(diào)LINC00483可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移
lncRNAs是隸屬于非編碼RNA家族的一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基的長(zhǎng)鏈大分子RNA轉(zhuǎn)錄物[8]。越來(lái)越多的證據(jù)表明LncRNAs廣泛參與修飾腫瘤的多個(gè)生物學(xué)行為過(guò)程,包括腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲轉(zhuǎn)移等等[9-10]。LncRNAs可通過(guò)作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因的相互作用,也可通過(guò)“海綿”的方式與微小RNA(miRNA)或蛋白相結(jié)合,還可作為增強(qiáng)子修飾其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[11-13]。一些矛盾表達(dá)的lncRNAs可通過(guò)作為癌基因或者抑癌基因的方式對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到重要的調(diào)控作用[7,14]。
長(zhǎng)基因間非編碼RNA 483(LINC00483)位于人染色體17q21.33,全長(zhǎng)共825個(gè)堿基。目前有關(guān)LINC00483的相關(guān)報(bào)道極少。D.Li等[15]發(fā)現(xiàn)LINC00483在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)增高,LINC00483可通過(guò)吸附內(nèi)源性抑癌基因miR-30a-3p的方式提升精子相關(guān)抗原9(SPAG9)的表達(dá)并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),LINC00483在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織;且其在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29及LOVO中的表達(dá)同樣高于人正常腸上皮細(xì)胞系NCM460。也就是說(shuō)LINC00483在結(jié)直腸癌中的表達(dá)升高。
結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移尤其是肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的一個(gè)重要因素,Y.Wang等[7]研究報(bào)道,LncRNAs DANCR在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高,DANCR可通過(guò)作為miR-577的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)的方式調(diào)節(jié)熱休克蛋白27(HSP27)的表達(dá)并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Chen DL等研究發(fā)現(xiàn),LncRNAs XIST在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高,高表達(dá)的XIST與結(jié)直腸癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān),XIST可通過(guò)抑制miR-200b-3p的方式提高鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1(ZEB1)的表達(dá)并促進(jìn)ZEB1介導(dǎo)的結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移[16]。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)RNAi的方式下調(diào)了LINC00483在HT29及LOVO細(xì)胞中的表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后,HT29及LOVO細(xì)胞中LINC00483的表達(dá)明顯降低,證實(shí)轉(zhuǎn)染獲得了成功。進(jìn)一步通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)考察LINC00483對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。本研究結(jié)果顯示,相比于轉(zhuǎn)染siSCR組,轉(zhuǎn)染siLINC00483組細(xì)胞的侵襲及遷移能力均明顯降低,也就是說(shuō)下調(diào)LINC00483可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29及LOVO侵襲轉(zhuǎn)移。
同其他多數(shù)惡性腫瘤一樣,結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程是一個(gè)多通路多因子共同作用的復(fù)雜的病理學(xué)過(guò)程。lncRNAs發(fā)揮作用的機(jī)制很多也較為復(fù)雜,其下游的分子眾多。本研究?jī)H僅初步檢測(cè)了LINC00483在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況并初步探討了其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。將進(jìn)一步的研究中深入探討LINC00483的具體作用機(jī)制并明確其可能調(diào)控或協(xié)同作用的靶分子,為分子靶向治療結(jié)直腸癌提供新思路。