小膠質(zhì)細(xì)胞激活研究中免疫組化和熒光技術(shù)的應(yīng)用

王羽茜， 張思然， 陳 璐，3， 李成檀，鄭 威， 王瓊珠， 趙建波， 王艷芳，張麗慧

(1.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)市級重點實驗室，浙江 杭州 310036;2. 浙江醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310013; 3. 常州衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 常州 213002)

腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease， PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)以及腦缺血損傷的共同病理過程，在腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在腦內(nèi)廣泛分布。各種病理刺激可誘導(dǎo)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，炎癥分子表達(dá)和釋放增加與神經(jīng)元變性死亡密切相關(guān)[1-2]。在神經(jīng)炎癥過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能改變以及炎癥分子表達(dá)變化需要基于細(xì)胞分子基礎(chǔ)的直觀研究方法。免疫組化(immunohistochemistry， IHC)和免疫熒光(immunofluorescence， IF)結(jié)合顯微成像分析技術(shù)使神經(jīng)炎癥的可視化研究成為可能，已成為神經(jīng)科學(xué)研究的重要方法[3-5]。本研究應(yīng)用IHC和IF方法結(jié)合顯微成像技術(shù)，監(jiān)測小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導(dǎo)的大鼠腦組織及體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活改變，并探討炎癥激活過程中的LPS濃度依賴性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔抗離子鈣接頭蛋白分子1(ionized calcium binding adaptor molecule 1， Iba-1)抗體購于日本W(wǎng)ako公司，羊抗Iba-1抗體購于英國abcam公司，兔抗白細(xì)胞介素1beta(interleukin1beta， IL1beta)抗體購于英國abcam公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標(biāo)記的熒光微珠(直徑1μm)購于美國Inventrogen公司，LPS和DAPI購于美國Sigma公司；BX51熒光生物顯微鏡購于日本Olympus公司，CCD攝像頭(WV-CP-230)購于日本松下公司，石蠟切片機(RM2235)購于德國Leica公司，CO2培養(yǎng)箱購于美國Forma Scientific公司。

1.2 大鼠腦炎癥模型 健康成年雄性Sprague-Dawleg(SD)大鼠，體重200～250 g，由杭州師范大學(xué)動物實驗中心提供。所有動物實驗遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，大鼠稱重分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，12 h明暗循環(huán)，室溫22～25 ℃。大鼠隨機分為對照組和LPS組，LPS組腹腔注射LPS 2.5 mg/kg；對照組腹腔注射等容生理鹽水。兩組分別給藥7 d后麻醉處死取腦，常規(guī)固定和處理后制作8 μm腦組織石蠟切片。

1.3 Iba-1免疫組化染色 取腦炎癥模型大鼠腦組織石蠟切片42 ℃烤片2 h，再經(jīng)脫蠟和水化后，枸櫞酸鈉緩沖溶液高溫高壓修復(fù)。TBST洗3次，5 min/次，5% BSA室溫封閉1 h后，加1∶200羊抗 Iba-1一抗(5% BSA稀釋)4℃過夜?；厥找豢购?，切片TBST洗3次，5 min/次。3% H2O2覆蓋15 min后，再TBST洗3次，5 min/次。滴加反應(yīng)增強液，室溫孵育20 min，TBST洗3次，5 min/次。增強酶標(biāo)兔抗山羊IgG聚合物室溫孵育20 min，TBST洗3次，5 min/次。DAB避光顯色15 min，流水沖洗后擦干，組織脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡拍攝。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)BV2細(xì)胞系細(xì)胞采用含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5 % 二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 d換1 次培養(yǎng)液。細(xì)胞密度長至80%左右時，1∶2傳入至新的培養(yǎng)皿。

1.5 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能檢測 將BV2細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板，貼壁生長24 h后作相應(yīng)藥物處理。每孔加入直徑1 μm熒光微珠0.4 μL，37℃孵箱溫育1 h。室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次；然后4%多聚甲醛37℃固定15 min，吸棄并晾干；室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。破膜：室溫下0.1% Triton X-100(0.01mol/L PBS稀釋)孵育10 min；0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次。5%羊血清(PBS稀釋)室溫封閉2 h?；厥昭蜓?，添加兔源Iba-1抗體(1∶2000)，室溫下?lián)u床孵育30 min后濕盒4℃過夜。0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次，滴加用0.01mol/L PBS稀釋的熒光二抗FITC-抗兔IgG(1∶200)，室溫避光孵育2 h后，0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。熒光顯微鏡下拍攝計數(shù)，以熒光微球在細(xì)胞膜內(nèi)為陽性細(xì)胞，吞噬率=(陽性細(xì)胞數(shù) /細(xì)胞總數(shù))×100%，藥物處理組數(shù)值為相對于對照組的百分比。

1.6 IL1beta免疫熒光染色 BV2細(xì)胞接種于無菌激光共聚焦培養(yǎng)皿中，貼壁生長24 h后作相應(yīng)藥物處理。室溫下，0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛37℃固定15 min，吸棄并晾干。室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。破膜：室溫下0.1% Triton X-100(0.01 mol/L PBS稀釋)孵育10 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次，5%羊血清(PBS稀釋)室溫封閉1h?；厥昭蜓?，添加用抗體稀釋液配制的兔源IL1beta抗體(1∶800)，濕盒4 ℃過夜。0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次，避光滴加用0.01mol/L PBS稀釋的Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗(1∶1000)，37℃避光孵育2 h，0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。1∶1000 DAPI室溫染色10 min，PBS洗3次，5 min/次。熒光顯微鏡拍攝。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗顯著差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦炎癥模型中小膠質(zhì)細(xì)胞激活 對照組大鼠大腦皮層有少量Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較小，細(xì)胞突起成細(xì)長分支狀。與對照組比較，2.5 mg/kg LPS組大鼠皮層Iba-1陽性細(xì)胞胞體變大、深染，突觸變短變粗，細(xì)胞形態(tài)多變。見圖1。

A： 對照組; B～D： 2.5 mg/kg LPS組 (標(biāo)尺=20 μm); E： 小膠質(zhì)細(xì)胞照片拍攝腦區(qū)。圖1 IHC檢測大鼠腦炎癥模型中皮層小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

2.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性 對照組可見少量BV2細(xì)胞內(nèi)有FITC標(biāo)記的熒光微球。LPS處理后，吞噬熒光微球的BV2細(xì)胞數(shù)量增加，10 ng/mL LPS組和100 ng/mL LPS組BV2細(xì)胞熒光微球吞噬率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A：對照組；B：1 ng/mL LPS組；C：10 ng/mL LPS組；D：100 ng/mL LPS組；E：小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性統(tǒng)計分析(n=4)，與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01；標(biāo)尺=20 μm。圖2 IF法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性改變

2.3 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL1beta表達(dá) 采用IL1beta抗體IF染色結(jié)果顯示，對照組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Alexa Fluor 555標(biāo)記的IL1beta蛋白呈現(xiàn)微弱的紅色熒光，100 ng/mL LPS處理后，BV2細(xì)胞Alexa Fluor 555標(biāo)記的IL1beta蛋白紅色熒光增強，見圖3。

A～C： 對照組; D～F： 100 ng/mL LPS組; 標(biāo)尺=20 μm。圖3 IF染色顯示BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL1 beta表達(dá)變化

3 討論

腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活是導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡的關(guān)鍵因素。LPS是經(jīng)典的小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑，常用于制作腦損傷炎癥動物和細(xì)胞模型[5-9]。研究表明[5-6]，LPS可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及增加神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)合成和釋放。腦內(nèi)或全身給予LPS，可誘導(dǎo)大鼠和小鼠的黑質(zhì)和海馬等腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，并進(jìn)一步介導(dǎo)神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙[7-9]。在本研究預(yù)實驗中，以1.25～10 mg/kg LPS連續(xù)腹腔注射， 1.25 mg/kg LPS未能誘導(dǎo)明顯的腦內(nèi)炎癥，而5 mg/kg LPS和10 mg/kg LPS處理后，大鼠死亡率增加，故本研究選用2.5 mg/kg LPS作為制作大鼠腦內(nèi)炎癥的合適劑量。

Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物，在靜息或激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[10]。本研究應(yīng)用抗Iba-1抗體IHC染色結(jié)果表明，生理鹽水對照組大鼠皮層Iba-1蛋白呈弱表達(dá)，只見少量靜息小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體小有細(xì)長突起。LPS處理組大鼠皮層Iba-1蛋白表達(dá)增高，Iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)增殖與形態(tài)改變，細(xì)胞體變大、深染，突起變粗變短，表明小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性激活，提示應(yīng)用LPS成功建立了大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型，為今后課題組開展動物水平抗小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥藥物研究奠定了基礎(chǔ)。

吞噬活性是神經(jīng)炎癥研究中評價小膠質(zhì)激活的另一重要指標(biāo)。體內(nèi)外系列研究表明[11-13]，過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬是腦缺血后神經(jīng)元遲發(fā)性死亡和缺失的重要原因；抑制腦缺血、魚藤酮和LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬可減輕神經(jīng)元死亡和神經(jīng)損傷，提示病理條件下異常的細(xì)胞吞噬在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥及神經(jīng)元死亡中的作用。小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞具有高度純化、能穩(wěn)定傳代并保持原代小膠質(zhì)細(xì)胞的特性，常用于小膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)研究[5，14]。本研究首先應(yīng)用IF方法結(jié)合顯微攝像技術(shù)觀察LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞吞噬FITC-標(biāo)記熒光微球活性改變，結(jié)果顯示，LPS可促進(jìn)BV2細(xì)胞熒光微球吞噬率增加，且呈濃度依賴性。本研究進(jìn)一步以流式細(xì)胞法檢測同樣處理的BV2細(xì)胞的吞噬功能[5]，結(jié)果顯示，流式細(xì)胞法檢測結(jié)果與IF法結(jié)果一致，提示IF法作為一個簡便有效直觀的檢測小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬方法，可用于細(xì)胞吞噬活性研究的初篩。

IL1beta是激活小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放的重要炎癥細(xì)胞因子，在AD、PD和腦缺血等腦損傷中具有重要作用[15]。課題組應(yīng)用PD體外模型，ELISA方法檢測結(jié)果表明[5，14]，魚藤酮和LPS處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥細(xì)胞因子IL1beta和IL6濃度增加；以魚藤酮和LPS處理的BV2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)PC12細(xì)胞可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)毒性；5-脂氧酶抑制劑和半胱氨酰白三烯受體拮抗劑可抑制魚藤酮和LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)物，可減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。本研究進(jìn)一步以IF染色方法直觀地證實LPS可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL1beta的表達(dá)。

綜上所述，系統(tǒng)應(yīng)用IHC和IF技術(shù)并結(jié)合其他細(xì)胞和分子生物學(xué)實驗方法，如PCR、Western blot、ELISA以及流式細(xì)胞術(shù)，可以多視角多方位地闡述神經(jīng)炎癥改變，對揭示小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥相關(guān)的中樞退行性疾病和腦缺血的病理生理機制以及尋找潛在的治療藥物具有理論和實際意義。