18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨的殺螨活性

郭宇俊, 韓俊艷, 李志強(qiáng), 楊詩(shī)博

(沈陽(yáng)大學(xué) 城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110044)

二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch)可寄生于玉米、高粱、蘋果、桃、杏、梨、李、葡萄、櫻桃、棉、豆類等多種植物中,是一種世界性的有害生物[1-2],由于其具有高繁殖力和一代短的特點(diǎn),在短期內(nèi)可以達(dá)到非常高的種群密度,對(duì)農(nóng)作物構(gòu)成嚴(yán)重威脅.二斑葉螨傷害植物后,植物的葉綠素含量減少,從而使農(nóng)作物大量減產(chǎn).目前對(duì)二斑葉螨的治理主要使用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥,長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,同時(shí)導(dǎo)致害螨產(chǎn)生抗藥性,害螨藥物防治效果降低,加重了害螨對(duì)農(nóng)作物造成的損失[3-6].據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)對(duì)植物危害嚴(yán)重的螨類約40余種,對(duì)殺螨劑的需求量為生產(chǎn)量的4倍,供不應(yīng)求[7].目前人們?cè)絹碓街匾暽鷳B(tài)環(huán)境問題,在人口迅速增長(zhǎng)、環(huán)境污染嚴(yán)重的今天,研究和開發(fā)高效、低毒和對(duì)環(huán)境友好的植物源農(nóng)藥具有重要意義.

植物本身含有次生代謝物用于抗御病蟲害,次生代謝物能與害蟲長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化,不耐受,對(duì)環(huán)境污染低,對(duì)人畜健康無(wú)害.我國(guó)地大物博,植物資源豐富,植物源殺螨劑開發(fā)潛力大,能夠?yàn)閷ふ覛Ⅱ参锾峁﹫?jiān)實(shí)的基礎(chǔ).目前我國(guó)高精密儀器的研制與生物技術(shù)的迅速發(fā)展,已經(jīng)使我國(guó)的植物源農(nóng)藥處于國(guó)際上游水平.盡管研制植物性殺螨劑的成本相對(duì)較高,但隨著社會(huì)的發(fā)展,人們生活水平不斷提高,市場(chǎng)需求會(huì)越來越大.由此可見,植物源殺螨劑在我國(guó)的發(fā)展前景十分廣闊,在今后的害蟲綜合防治中具有重要意義[8].筆者在遼寧大連瓦房店市山區(qū)采集了14科18種植物,制備了乙醇提取物,對(duì)二斑葉螨雌成螨和卵進(jìn)行了室內(nèi)觸殺活性測(cè)定及植物毒力測(cè)定,為篩選出高效的殺螨活性物質(zhì)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

從遼寧省瓦房店市山區(qū)采集18種植物作為供試材料,植物名稱和供試部位見表1.將植物材料洗凈陰干后,分別放入粉碎機(jī)中粉碎,過直徑0.180 mm的篩子,密封后保存于冷藏柜中備用.

(1) 醇提物的制備.分別稱取20 g植物粉碎物,加入5倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,室溫下浸提3 d(每隔5 h振蕩1次),過濾.重復(fù)操作,每種植物浸提3次,將3次濾液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,獲得膏狀提取物,稱重,計(jì)算提取率后于冷藏柜中保存.

表1 18種測(cè)試植物名錄Table 1 List of 18 tested plants

提取率的計(jì)算方法為:

(2) 測(cè)試物的準(zhǔn)備.取膏狀提取物置于錐形瓶中,加入少量無(wú)水乙醇溶解后,再加入體積分?jǐn)?shù)為0.3%的吐溫-80水溶液溶解制成質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的供試藥液,備用.

1.2 供試螨

二斑葉螨由遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng).飼養(yǎng)在溫度為(25±1)℃、濕度為60%～65%,每天光照與黑暗時(shí)間比為 16 h∶8 h的人工氣候箱中.

1.3 測(cè)試方法

(1) 二斑葉螨觸殺活性測(cè)定.采用玻片浸漬法[9]并稍加改進(jìn),將雙面膠粘于載玻片的一端,用細(xì)頭油畫筆輕輕挑取活潑的雌成螨,將其背部粘在雙面膠上,保證螨足不被粘在雙面膠上,在顯微鏡下剔除不合格的雌成螨,用油畫筆觸動(dòng)螨體,螨足不動(dòng)者為不合格.最終保留每個(gè)載玻片上螨的頭數(shù)n=30.將載玻片一端置于供試藥液或空白對(duì)照溶液中,5 s后取出,用濾紙吸干螨四周多余的藥液,放入人工氣候箱中.24 h后觀察螨蟲存活數(shù)量,用油畫筆觸動(dòng)螨體,螨足不動(dòng)者為死亡,計(jì)算校正死亡率.以質(zhì)量濃度為0.3%吐溫-80水溶液為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次.

校正死亡率計(jì)算公式如下:

(2) 螨卵觸殺活性測(cè)定.選用葉片浸漬法[10]并略加改良,在培養(yǎng)皿中放入具有一定濕度的棉花,將新鮮的黑豆葉片放在棉花上,用細(xì)頭油畫筆輕輕挑取活潑的雌成螨,用濕棉花將葉片圍好,以防止害螨逃逸.待雌成螨產(chǎn)卵后,在顯微鏡下剔除多余的卵,留下30枚卵,將葉片浸入植物提取物供試藥液或質(zhì)量濃度為0.3%吐溫-80對(duì)照藥液中,5 s后取出,用濾紙小心吸去多余藥液.置于人工氣候箱中培養(yǎng),7 d后觀察孵化情況,沒有孵化的卵視為死亡,統(tǒng)計(jì)各測(cè)試組螨卵的孵化率,每個(gè)處理重復(fù)3次.

(3) 高效殺螨活性植物提取物對(duì)二斑葉螨的毒力測(cè)定.將波斯菊、銀杏、紫花地丁、四季海棠和煙草提取物配制成12.8、6.4、3.2、1.6和0.8 mg·mL-15個(gè)不同質(zhì)量濃度的供試藥液,采用玻片浸漬法對(duì)二斑葉螨的雌成螨進(jìn)行毒力活性測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18軟件Probit分析,并計(jì)算毒力回歸方程、半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)及95%置信區(qū)間.利用DPS軟件進(jìn)行Duncan顯著性分析.

2 結(jié)果分析

2.1 18種植物的乙醇提取物提取率

由表2可見,植物用體積濃度為95%的乙醇浸提,槐樹的浸提率最低,僅為6.4%,蒲公英的浸提率最高,為17.05%.18種供試植物的乙醇提取率由高到低依次為:蒲公英、酸棗、爬山虎、狗尾巴草、蒼耳、三葉草、紫花地丁、艾草、回回蒜、楸樹、四季海棠、銀杏、煙草、龍葵、波斯菊、平車前、水柳、槐樹.

2.2 18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨的觸殺作用

由表2可見,當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的18種植物乙醇提取物處理二斑葉螨24 h后,所測(cè)試的18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨有不同程度的觸殺作用.波斯菊、煙草、銀杏殺螨作用較強(qiáng),校正死亡率達(dá)到90%以上.四季海棠、紫花地丁、平車前、龍葵、狗尾巴草、三葉草、爬山虎、蒲公英和回回蒜的乙醇提取物也有一定的殺螨活性,校正死亡率在50%～80%.槐樹、楸樹、艾草、酸棗、蒼耳、水柳的乙醇提取物殺螨作用較弱,校正死亡率低于50%.

表2 18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨的觸殺活性(n=30)Table 2 Toxicity of ethanol extracts of 18 plants against adult female mites of Tetranychus urticae Koch (n=30)

注: 表中縱列數(shù)據(jù)后字母,小寫字母相同者表示在5%水平差異不顯著,大寫字母相同者表示在1%水平極不顯著.

2.3 18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵的觸殺作用

18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵的觸殺活性結(jié)果見表3.波斯菊、蒼耳、煙草、龍葵、銀杏、紫花地丁和酸栆的乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵的孵化有較好的抑制作用,四季海棠、槐樹、艾草、三葉草、爬山虎、蒲公英的乙醇提取物對(duì)螨卵的觸殺活性較弱,楸樹、狗尾巴草、平車前、回回蒜、水柳的乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵無(wú)觸殺作用.

表3 18種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵的觸殺活性(n=30)Table 3 Contact toxicity of 18 Plant ethanol extracts against eggs of Tetranychus urticae Koch(n=30)

續(xù)表3

植 物 名 稱孵化率/%水柳Homonoia ripari93.30士1.96abcABC紫花地丁Viola philippica77.77士3.87ghiFGH三葉草Trifolium sp84.43士1.96efDEF爬山虎Parthenocissus tricuspidata87.80士1.91deBCDE煙草Nicotiana tabacum L73.33士5.77ijH0.3%吐溫-80水溶液97.80士1.91aA

注: 表中縱列數(shù)據(jù)后字母,小寫字母相同者表示在5%水平差異不顯著,大寫字母相同者表示在1%水平極不顯著.

2.4 5種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨的毒力作用比較

18種植物乙醇提取物通過對(duì)二斑葉螨雌成螨和卵進(jìn)行觸殺活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)波斯菊、銀杏、煙草、四季海棠和紫花地丁5種植物提取物對(duì)二斑葉螨表現(xiàn)出較好的生物活性.將5種植物的乙醇提取物分別配成12.8、6.4、3.2、1.6、和0.8 mg·mL-15個(gè)不同質(zhì)量濃度的供試藥液,對(duì)二斑葉螨雌成螨的觸殺毒力進(jìn)行線性回歸分析,進(jìn)一步評(píng)價(jià)這5種植物提取物對(duì)二斑葉螨的毒力.

由表4可見,波斯菊、銀杏、煙草、紫花地丁、四季海棠5種植物乙醇提取物物對(duì)二斑葉螨雌成螨均表現(xiàn)出較好的觸殺效果,LC50分別為3.178、3.642、3.200、5.535和5.522 mg·mL-1.

表4 5種植物乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨的毒力(n=30)

注: 計(jì)算對(duì)雌成螨的LC50時(shí)用處理 24h后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

3 討論與結(jié)論

本文對(duì)在遼寧大連瓦房店市山區(qū)采集的14科18種植物的乙醇提取物進(jìn)行了殺螨活性測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果顯示,波斯菊、煙草、銀杏殺螨作用較強(qiáng),校正死亡率達(dá)到 90%以上.18種植物乙醇取物對(duì)二斑葉螨卵的觸殺試驗(yàn)結(jié)果顯示,波斯菊、龍葵、蒼耳、煙草、銀杏、紫花地丁和酸棗的乙醇提取物對(duì)二斑葉螨卵的孵化有較好的抑制作用;波斯菊的乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨與卵的觸殺作用均較明顯.波斯菊(Cosmos bipinnatus),又叫秋英,喜光喜溫暖,為菊科秋英屬1年生或多年生草本植物,其既是一種重要的觀賞性植物[11],也是一種中藥材.波斯菊因其花期短、花色種類多,生命力強(qiáng),易于生長(zhǎng),環(huán)境效益好等特點(diǎn),常以草花混播的形式廣泛應(yīng)用于園林綠化中[12].王丹等[13]發(fā)現(xiàn)波斯菊的根、莖葉和花序等不同部位的浸液對(duì)矢車菊和硫磺菊的幼苗根的生長(zhǎng)具有抑制作用,對(duì)硫磺菊苗高有促進(jìn)作用.低濃度的波斯菊浸液對(duì)矢車菊和雞冠花幼苗生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[14].波斯菊藥用價(jià)值很高,常外用治癰瘡腫毒,因其能夠治療慢、急性痢疾, 民間常稱其為“痢疾草”,劉丹丹等[15]研究波斯菊水提物對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織的形態(tài)影響,發(fā)現(xiàn)波斯菊種子水提物能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠肝臟糖代謝作用;朱浩等[16]發(fā)現(xiàn)波斯菊種子水提物能夠延緩糖尿病小鼠肝腎損傷;賈利紅等[17]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.5mg·mL-1的波斯菊種子水提物能夠控制糖尿病小鼠血糖接近正常水平;楊春華等[18]發(fā)現(xiàn)混有波斯菊成分的藥品能夠促進(jìn)小鼠皮膚缺損性創(chuàng)傷愈合.波斯菊屬于菊科植物,近年來菊科植物在開發(fā)殺蟲植物源農(nóng)藥方面的價(jià)值日益受到關(guān)注,菊科植物含有多種光活化毒素,萬(wàn)壽菊、孔雀藍(lán)等對(duì)致倦庫(kù)蚊有很好的光活化活性[19].張?zhí)熘萚20]發(fā)現(xiàn)鯉腸和萬(wàn)壽菊提取物在近紫外光下對(duì)淡色庫(kù)蚊和松材線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的光活化毒殺作用.李云壽等[21]對(duì)14種菊科植物分別用6種溶劑提取活性成分進(jìn)行菜青蟲的殺蟲活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)黃花蒿和魚眼草等乙醇和甲醇的提取物的殺蟲活性成分較高.菊科植物紫莖澤蘭提取物能夠有效防治粘蟲[22].本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)波斯菊提取物具有殺葉螨作用,可能與其他菊科殺蟲植物具有相似的活性成分與作用機(jī)制.

總之,本試驗(yàn)結(jié)果表明波斯菊具有殺螨活性,有必要進(jìn)行深入研究.試驗(yàn)只選擇1種害螨即二斑葉螨為研究對(duì)象,試驗(yàn)結(jié)果不能完全替代所有螨類均成立,為了完善波斯菊提取物的殺螨譜,應(yīng)在未來的試驗(yàn)中增加其他螨類作為試驗(yàn)對(duì)象.試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步研究其他有機(jī)溶劑提取物對(duì)二斑葉螨的殺螨活性,以及進(jìn)一步通過純化有效成分,尋找活性單體,闡明毒理機(jī)制,為開發(fā)新型植物殺螨劑奠定基礎(chǔ).