檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因在L-亮氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用

馬躍超，崔 毅，杜麗紅，陳 寧*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-亮氨酸是人體八種必需氨基酸之一[1]，對肌肉組織的生長發(fā)育具有重要意義[2-3]。L-亮氨酸是機(jī)體重要的能量供體[4]，當(dāng)人體處于運(yùn)動、饑餓以及創(chuàng)傷等特殊生理狀態(tài)時，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充L-亮氨酸能夠有效緩解各種不適癥狀[5-6]。此外，在臨床上L-亮氨酸還被應(yīng)用于術(shù)后營養(yǎng)支持，以及肝臟、腎臟疾病的治療等[7-8]。L-亮氨酸無法在人和動物體內(nèi)合成，因此，必須從食物中攝取或者通過服用含有L-亮氨酸的功能性食品或藥品獲得[9]。

自然界中的L-亮氨酸主要由植物和微生物合成，而微生物發(fā)酵法是目前L-亮氨酸最主要的生產(chǎn)方式。由于L-亮氨酸的合成途徑長、反饋調(diào)控機(jī)制嚴(yán)格，L-亮氨酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率仍然較低[10]。目前，大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的主要菌株，其中谷氨酸棒桿菌作為一種常見的工業(yè)微生物，常被改造用作各種氨基酸、有機(jī)酸以及生物燃料等產(chǎn)品的生產(chǎn)菌株[11]。VOGT M等[12]引入突變的乙酰乳酸合酶編碼基因ilvBN和異丙基蘋果酸合酶編碼基因leuA解除代謝產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的反饋抑制；張躍等[13]通過敲除轉(zhuǎn)錄調(diào)控阻遏蛋白LtbR提高亮氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄水平；HUANG Q等[14]通過敲除丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因alaT、乳酸脫氫酶編碼基因ldh和蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA等阻斷了代謝副產(chǎn)物（L-丙氨酸、乳酸和L-異亮氨酸）的合成，L-亮氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率得到明顯提升；劉輝等[15]通過代謝計量分析，對L-亮氨酸發(fā)酵所使用的碳源進(jìn)行比較，提出葡萄糖有利于菌體生長并提供充足的碳架，而使用蔗糖則更有利于提高糖酸轉(zhuǎn)化率。

在谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中，L-亮氨酸的合成需要以丙酮酸和乙酰輔酶A作為前體物[16]，構(gòu)建檸檬酸合酶缺失的菌株能夠有效減少丙酮酸和乙酰輔酶A的消耗，有助于提高L-亮氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，但是也會對細(xì)胞生長造成嚴(yán)重影響。通過在培養(yǎng)基中添加檸檬酸，能夠在一定程度上回補(bǔ)檸檬酸缺陷，但是由于谷氨酸棒桿菌的檸檬酸攝取效率較低，不能有效地將培養(yǎng)基中的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。因此，本研究利用同源重組方法[17]使L-亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumALDP的檸檬酸合酶失活，并引入檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因CP_103，獲得一株能高效攝取檸檬酸的菌株；在此基礎(chǔ)上，比較不同的檸檬酸添加方式對菌體生長、L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響。旨在通過對谷氨酸棒桿菌中L-亮氨酸生產(chǎn)的中心碳代謝進(jìn)行修飾以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高L-亮氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

本研究所使用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

表1 本研究所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g/L，KH2PO46 g/L，K2HPO44g/L，MgSO4·7H2O1g/L，維生素H（vitaminH，VH）10mg/L，瓊脂粉25 g/L；根據(jù)碳源需求，加入葡萄糖或檸檬酸30 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，玉米漿30mL/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，滅菌后加入卡那霉素（10 μg/mL）和氯霉素（10 μg/mL）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，酵母粉2 g/L，玉米漿30 mL/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，維生素B110 mg/L，滅菌后加入卡那霉素（10 μg/mL）和氯霉素（10 μg/mL）。

上述培養(yǎng)基的滅菌方式均為115℃、15 min。

1.1.3 試劑

PrimeSTARRHS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） 聚合酶、QuickCutTMHind III和QuickCutTMEcoR I：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit：南京諾唯贊生物科技有限公司；L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；硫酸卡那霉素（純度＞94%）、氯霉素（純度98%）和蔗糖（生化試劑）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；玉米漿：河南巨龍生物工程股份有限公司；檸檬酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler nexus聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、NBS Bio-Flu 110 3L和7.5 L發(fā)酵罐：德國Eppendorf NBS公司；V-1200型可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；S-433D全自動氨基酸分析儀：北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司；mini Spain DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Prominence模塊化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建

檸檬酸合酶編碼基因gltA的敲除：以C.glutamicum AN02的基因組DNA為模板，利用引物P1/P2和P3/P4分別擴(kuò)增gltA基因的上、下游序列，再利用引物P1/P4通過重疊延伸PCR將兩段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接；重疊延伸PCR產(chǎn)物與pK18mobsacB質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切；利用同源重組酶將重疊延伸PCR產(chǎn)物與線性化的pK18mobsacB質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA（圖1）；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞C.glutamicumAN02中，利用含有卡那霉素（10 μg/mL）的LB培養(yǎng)基和含有蔗糖（10 g/L）的LB培養(yǎng)基篩選獲得gltA基因缺失的菌株C.glutamicum AN02ΔgltA，使用引物P13和P14進(jìn)行鑒定。

圖1 質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA的構(gòu)建流程Fig.1 Construction process of pK18mobsacB-ΔgltAplasmid

檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因CP_103的整合：首先以C.glutamicumAN02的基因組DNA為模板，利用引物P5/P6和P11/P12分別擴(kuò)增假蛋白編碼基因Cgl2103的上、下游序列，利用引物P7/P8擴(kuò)增Ptuf啟動子序列，再以C.glutamicumCP的基因組DNA為模板，利用引物P9/P10擴(kuò)增CP_103基因序列，最后利用引物P5/P12通過重疊延伸PCR將四段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接；重疊延伸PCR產(chǎn)物與pK18mobsacB質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶Hind III和EcoR I消化；利用同源重組酶將重疊延伸PCR產(chǎn)物與線性化的pK18mobsacB質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-CP_103（圖2）；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞C.glutamicumAN02ΔgltA中，利用含有卡那霉素（10μg/mL）的LB培養(yǎng)基和含有蔗糖（10g/L）的LB培養(yǎng)基篩選獲得整合了Ptuf啟動子和CP_103基因的菌株C.glutamicum AN02ΔgltACP_103，使用引物P15和P16對Ptuf啟動子和CP_103基因進(jìn)行鑒定。

圖2 質(zhì)粒pK18mobsacB-CP_103的構(gòu)建流程Fig.2 Construction process of pK18mobsacB-CP_103plasmid

將pXT01+leuBCD（用于過表達(dá)異丙基蘋果酸脫氫酶編碼基因leuB和異丙基蘋果酸脫水酶編碼基因leuCD）和pEC-XK99E+leuACP（用于過表達(dá)異丙基蘋果酸合酶突變基因leuACP）均分別轉(zhuǎn)化至C.glutamicumAN02ΔgltA和C.glutamicumAN02ΔgltACP_103中獲得重組菌株C.glutamicumALDPΔgltA和C.glutamicumALDPΔgltACP_103。

1.3.2 重組菌株的培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板培養(yǎng)：在無菌條件下，用接種環(huán)從甘油管中沾取少量菌液，分別以三區(qū)劃線的方式接種于以葡萄糖或檸檬酸為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板，倒置于32℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。

搖瓶培養(yǎng)：在無菌條件下，用接種環(huán)取一環(huán)活化菌體接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的500mL圓底三角瓶中，32℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值為10～12。取3 mL種子培養(yǎng)液接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，32℃、200 r/min條件下培養(yǎng)32 h。培養(yǎng)過程中，根據(jù)指示劑苯酚紅的顏色變化，用25%氨水調(diào)整發(fā)酵液的pH在6.4～7.2范圍內(nèi)；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度＜10g/L時，補(bǔ)加1～2mL60%的葡萄糖溶液。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，取活化的菌體接種于裝有1.6L種子培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中于32℃條件下培養(yǎng)，采用25%氨水維持發(fā)酵液pH在7.0～7.2范圍內(nèi)，通過調(diào)整攪拌和通風(fēng)維持溶氧在25%～30%，培養(yǎng)至OD600nm為14～16時，將300 mL種子培養(yǎng)液接種于裝有3.7 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5 L發(fā)酵罐中于32℃條件下培養(yǎng)32 h，用25%氨水維持發(fā)酵液的pH在7.0～7.2范圍內(nèi)，通過調(diào)整攪拌和通風(fēng)維持溶氧在25%～30%，通過流加80%葡萄糖溶液維持發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度≥10 g/L，通過流加60%檸檬酸溶液維持發(fā)酵液中檸檬酸質(zhì)量濃度在1～5 g/L、5～10 g/L、10～15 g/L和15～20 g/L的范圍內(nèi)。

1.3.3 檢測方法

OD600nm值和葡萄糖含量的測定方法參考文獻(xiàn)[18]。

L-亮氨酸含量的測定[21]：發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心3 min，上清液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后加入900 μL 2%磺基水楊酸溶液中，靜置15 min，在12 000 r/min條件下離心15 min，取800 μL上清液經(jīng)孔徑為0.15 μm的濾膜過濾后，利用S-433D全自動氨基酸分析儀測定L-亮氨酸含量。

檸檬酸含量的測定[20]：發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心3 min，上清液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，用孔徑為0.15 μm的濾膜過濾，利用HPLC測定檸檬酸含量。HPLC條件：色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），流動相為5 mmol/L硫酸，流速0.5 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為215 nm。

根據(jù)L-亮氨酸和檸檬酸的含量計算糖酸轉(zhuǎn)化率，計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA的構(gòu)建

gltA基因的上、下游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA相關(guān)序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of sequences relating to the construction of recombinant plasmid pK18mobsacB-ΔgltA

由圖3可知，gltA基因的上、下游序列擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為503bp和493bp，重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為996bp，PCR擴(kuò)增結(jié)果與理論預(yù)期相符。利用同源重組的方法將重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pK18mobsacB質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA。

2.1.2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB-CP_103的構(gòu)建

Cgl2103基因的上、下游序列和Ptuf啟動子的序列、CP_103基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。

圖4 構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18mobsacB-CP_103相關(guān)序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of sequences relating to the construction of recombinant plasmid pK18mobsacB-CP_103

由圖4可知，Cgl2103基因的上、下游序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度分別為512 bp和494 bp，Ptuf啟動子序列長度為390bp，CP_103基因序列長度為1581bp，重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為2977bp，PCR擴(kuò)增結(jié)果與理論預(yù)期相符。利用同源重組的方法將重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pK18mobsacB質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pK18mobsacB-CP_103。

2.1.3 工程菌株的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔgltA轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞C.glutamicumAN02中，使用引物P13和P14鑒定gltA基因缺失菌株C.glutamicumAN02ΔgltA；將重組質(zhì)粒pK18mobsacBCP_103轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞C.glutamicumAN02ΔgltA中，使用引物P15和P16鑒定整合了Ptuf啟動子和CP_103基因的菌株C.glutamicumAN02ΔgltACP_103。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖5所示。

圖5 重組菌株谷氨酸棒狀桿菌AN02ΔgltA和谷氨酸棒狀桿菌AN02ΔgltACP_103的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Identification results of recombinant strainsC.glutamicum AN02ΔgltAandC.glutamicumAN02ΔgltACP_103by PCR

由5（A）可知，利用鑒定引物P13和P14對gltA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以C.glutamicumAN02和C.glutamicumAN02 ΔgltA的基因組為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度分別為2 232 bp和1 109 bp，表明C.glutamicumAN02ΔgltA菌株的gltA基因已經(jīng)成功被敲除；由圖5（B）所示，利用鑒定引物P15和P16對Cgl2103基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以C.glutamicumAN02和C.glutamicumAN02ΔgltACP_103的基因組為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度分別為1 744 bp和3 007 bp，表明Ptuf啟動子和CP_103基因已經(jīng)成功地整合到C.glutamicumAN02 ΔgltACP_103菌株的Cgl2103基因內(nèi)部。最后將pXT01+leuBCD和pEC-XK99E+leuACP均分別轉(zhuǎn)化至C.glutamicum AN02ΔgltA和C.glutamicumAN02ΔgltACP_103中獲得C.glutamicumALDPΔgltA和C.glutamicumALDPΔgltACP_103。

2.2 檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因?qū)幟仕釘z取的影響

為驗(yàn)證C.glutamicumALDPΔgltACP_103的檸檬酸攝取能力，以C.glutamicumCP、C.glutamicumALDP和C.glutamicumALDPΔgltA為對照，分別在以葡萄糖和檸檬酸作為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上于32℃條件下培養(yǎng)48h，生長狀況如表3所示。

表3 菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況Table 3 Growth situation of strains on the media with different carbon sources

由表3可知，所有菌株均能在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，且具有較快的生長速率。而當(dāng)以檸檬酸為唯一碳源時，基因組上未整合CP_103基因的C.glutamicum ALDP和C.glutamicumALDPΔgltA均不能生長，或因生長速度過慢未能在48 h內(nèi)形成可見菌落；而C.glutamicum CP和基因組整合了CP_103基因的C.glutamicumALDP ΔgltACP_103均能以緩慢速度生長。由此可見，谷氨酸棒桿菌自身的檸檬酸攝取能力較弱，而引入檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因CP_103能夠顯著提升菌株的檸檬酸攝取能力。

2.3 檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因?qū)-亮氨酸合成的影響

為考察檸檬酸合酶缺失以及整合CP_103基因?qū)旰铣蒐-亮氨酸的影響，將菌株C.glutamicumALDP、C.glutamicumALDPΔgltA和C.glutamicumALDPΔgltACP_103分別在不添加檸檬酸和添加30 g/L檸檬酸的條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每組設(shè)置3個平行，發(fā)酵32 h，發(fā)酵過程中的菌體濃度、檸檬酸含量、L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別如圖6和圖7所示。

由圖6可知，在培養(yǎng)基中不添加檸檬酸的條件下，出發(fā)菌株C.glutamicumALDP最終的OD600nm值和L-亮氨酸產(chǎn)量最高，分別為58.6±4.4和（18.3±1.2）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為15.6%；而C.glutamicumALDPΔgltA和C.glutamicumALDP ΔgltACP_103的最終OD600nm值分別為14.1±2.2和13.9±2.4，L-亮氨酸產(chǎn)量分別為（4.7±1.1）g/L和（4.6±1.4）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為16.2%和16.3%。由此可見，在不添加檸檬酸的條件下，較菌株C.glutamicumALDP，敲除gltA基因的菌株的菌體濃度和L-亮氨酸產(chǎn)量都顯著下降（P＜0.001），而C.glutamicumALDPΔgltA和C.glutamicumALDPΔgltA CP_103兩株菌的生長和L-亮氨酸產(chǎn)量無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，盡管敲除gltA基因有利于降低丙酮酸和乙酰輔酶A的消耗、提高目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率[12]，但是會對細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成造成嚴(yán)重影響。

圖6 不添加檸檬酸條件下菌株的發(fā)酵結(jié)果Fig.6 Fermentation results of strains without citric acid addition

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加濃度為30 g/L的檸檬酸時，C.glutamicumALDP和C.glutamicumALDPΔgltA的最終OD600nm值分別為64.3±5.5和18.9±2.5，較不添加檸檬酸提高9.7%和34.0%；L-亮氨酸產(chǎn)量分別為（19.5±1.4）g/L和（6.8±1.1）g/L，較不添加檸檬酸提高6.6%和44.7%；糖酸轉(zhuǎn)化率分別為17.5%和18.6%，較不添加檸檬酸提高12.2%和14.8%。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加一定含量的檸檬酸有助于促進(jìn)菌體的生長和提高L-亮氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，且對于檸檬酸合酶缺失的菌株C.glutamicumALDPΔgltA的提升效果更明顯，這是因?yàn)樘砑拥臋幟仕嵩谝欢ǔ潭壬匣匮a(bǔ)了檸檬酸合酶缺失造成的檸檬酸缺陷。然而添加檸檬酸對于出發(fā)菌株C.glutamicumALDP的生長和產(chǎn)L-亮氨酸的影響并不顯著（P＞0.05），其主要原因?yàn)?，一方面C.glutamicumALDP細(xì)胞自身能夠正常合成檸檬酸，另一方面，C.glutamicumALDP的檸檬酸攝取能力有限，不能高效地將檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)。基因組整合了CP_103基因的C.glutamicumALDPΔgltACP_103的最終OD600nm值為25.7±2.8，L-亮氨酸產(chǎn)量為（10.4±1.6）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為19.3%，較不添加檸檬酸時分別提高84.9%，126.9%和18.4%，較C.glutamicumALDPΔgltA分別提高36.0%、52.9%、3.76%。由此可見，整合CP_103基因不僅有助于回補(bǔ)檸檬酸缺陷，還能夠進(jìn)一步優(yōu)化菌株碳代謝，從而提升L-亮氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

圖7 添加30 g/L檸檬酸對菌體生長（A）、檸檬酸攝取（B）及L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率（C）的影響Fig.7 Effects of citric acid addition 30 g/L on the cell growth(A),citric acid uptake(B),L-leucine production and the conversion rate of glucose to acid(C)of strain

在發(fā)酵結(jié)束時，C.glutamicumALDP和C.glutamicum ALDPΔgltA的發(fā)酵液中仍然殘留一定量的檸檬酸，而C.glutamicumALDPΔgltACP_103的發(fā)酵液中的檸檬酸在28 h時全部耗盡，但是C.glutamicumALDPΔgltACP103在發(fā)酵前期生長速率緩慢，其原因可能是C.glutamicum ALDPΔgltACP_103對檸檬酸的攝取過快，導(dǎo)致胞內(nèi)檸檬酸濃度過高，從而對葡萄糖的攝取和利用產(chǎn)生了一定的抑制作用。由此可見，盡管檸檬酸對于提高L-亮氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率具有明顯作用，但是前期添加過高濃度檸檬酸不利于菌體生長，因此仍需要對檸檬酸的添加方式進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 檸檬酸添加方式對L-亮氨酸合成的影響

在7.5 L發(fā)酵罐中，在初始發(fā)酵液中添加5 g/L檸檬酸，在發(fā)酵過程中通過流加的方式，維持檸檬酸質(zhì)量濃度分別在1～5g/L、5～10g/L、10～15g/L和15～20 g/L的范圍內(nèi)，發(fā)酵32 h，菌體生長、L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率如圖8所示。

由圖8A可知，在初始發(fā)酵液中添加5 g/L檸檬酸未對菌體生長造成明顯的抑制作用，在發(fā)酵過程中維持檸檬酸含量為5～10g/L范圍內(nèi)時，最有利于菌體生長，最終OD600nm值為42.1。當(dāng)檸檬酸含量＜5 g/L時，不能充分回補(bǔ)菌株的檸檬酸缺陷，而檸檬酸含量＞10 g/L則會對菌體生長產(chǎn)生抑制作用。由圖8B可知，在流加檸檬酸的條件下，L-亮氨酸的產(chǎn)量比在發(fā)酵開始時一次性添加30 g/L檸檬酸的條件下得到明顯提升。當(dāng)檸檬酸含量＜15 g/L時，L-亮氨酸的產(chǎn)量隨著檸檬酸濃度的提高而增加，當(dāng)檸檬酸含量在10～15g/L范圍時，L-亮氨酸產(chǎn)量最高，為（22.5±1.5）g/L，比一次性添加檸檬酸的產(chǎn)量提高116.3%；而檸檬酸含量＞15g/L時，由于菌體生長受到嚴(yán)重抑制，L-亮氨酸的產(chǎn)量未明顯增加。當(dāng)檸檬酸含量維持在10～15 g/L和15～20 g/L時，L-亮氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為23.1%和22.4%，較其他檸檬酸添加方式有明顯提高。綜上所述，初始發(fā)酵液中添加5 g/L檸檬酸，發(fā)酵過程中維持檸檬酸含量在10～15 g/L為C.glutamicumALDPΔgltACP_103的最佳發(fā)酵條件，較出發(fā)菌株C.glutamicumALDP的L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了23.0%和48.1%。

圖8 不同檸檬酸添加方式對菌體生長（A）及L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率（B）的影響Fig.8 Effects of different citric acid addition methods on the cell growth(A)and L-leucine production and the conversion rate of glucose to acid(B)of strain

3 結(jié)論

本研究通過引入檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變基因CP_103，顯著提高了檸檬酸合酶基因gltA缺失谷氨酸棒狀桿菌的檸檬酸攝取能力，在添加30 g/L檸檬酸的條件下，較C.glutamicumALDPΔgltA，C.glutamicumALDPΔgltACP103的OD600nm值、L-亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，分別提高36.0%、52.9%、3.76%。在此基礎(chǔ)上，通過對檸檬酸的添加方式進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)初始發(fā)酵液中的檸檬酸添加量為5 g/L，發(fā)酵過程中通過流加的方式維持檸檬酸含量在10～15 g/L范圍內(nèi)時，較出發(fā)菌株C.glutamicumALDP，C.glutamicum ALDPΔgltACP_103的L-亮氨酸產(chǎn)量最高，為（22.5±1.5）g/L、糖酸轉(zhuǎn)化率為23.1%，分別提高23.0%和48.1%，但菌體OD600nm值略微下降。