藜麥格瓦斯發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

孫子羽，滿都拉，郝 歡，溫 慧，劉 婷，陳忠軍*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）又稱藜谷、南美藜、昆諾阿藜等，是藜屬的一年生雙子葉植物，起源于南美洲安第斯山區(qū)，是該地區(qū)最早栽培的植物之一[1-2]。藜麥具有比大多數(shù)谷類作物蛋白質(zhì)含量更高、氨基酸比例更加均衡的優(yōu)點，且藜麥不含麩質(zhì)，適于對麩質(zhì)過敏的人群食用[3]。藜麥的維生素含量也很豐富（如維生素E、維生素C和B族維生素），還富含類胡蘿卜素、葉黃素和玉米素，這些物質(zhì)含量均高于常規(guī)谷物[4]。值得關(guān)注的是，藜麥中還含有豐富的黃酮、多酚和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)功能因子，具有抗氧化、降血脂、增強免疫等生理功效，從而能夠降低一些慢性疾病的發(fā)生風(fēng)險[5]。

格瓦斯是一種以谷物或面包為原料，由乳酸菌和酵母菌發(fā)酵而成的含酒精飲料[6]，與加利亞布扎、德國啤酒、美國可樂一同被譽為“世界四大民族飲品”[7-9]。格瓦斯口感醇香帶甜，具有開胃、健脾、增進人體消化功能等多種功效[10]，是可代酒助興的良好保健飲料。目前，對格瓦斯的研究主要集中在新品格瓦斯的開發(fā)上，方法主要是在原料中加入谷物、果蔬、花卉等[11-14]，而以藜麥為原料的格瓦斯鮮有報道。

本研究以大麥芽、焦香麥芽、藜麥為原料制備格瓦斯飲料，通過單因素試驗和正交試驗對格瓦斯發(fā)酵原料的配比及工藝進行優(yōu)化，并利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（head space solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法鑒定藜麥格瓦斯揮發(fā)性風(fēng)味成分，以期為藜麥杞格瓦斯中香味物質(zhì)的認(rèn)識和藜麥相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥、大麥芽、焦香麥芽：市售；酒花：新疆方睿啤酒原料制品有限責(zé)任公司；啤酒酵母、α-淀粉酶（40000U/g）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌：本實驗室分離篩選保存的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）；糖化酶（50 000 U/g）：山東樸正生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10精密電子pH計：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PAL-1糖度儀：日本ATAGO（愛拓）公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPME裝置：上海安譜實驗科技股份有限公司；Trace1300-ISQ型GC-MS聯(lián)用儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥格瓦斯生產(chǎn)工藝流程及操作要點

粉碎：將大麥芽、焦香麥芽、藜麥粉碎過40目篩備用。

液化：在混合好的麥芽中按料水比（1∶12）加入純凈水，然后加入0.5%的淀粉酶，85～95℃蒸煮1 h。

糖化：將液化好的麥芽汁降溫至65℃，添加4%的糖化酶，60℃水浴保溫1 h。

過濾：用雙層紗布過濾。

滅酶：將過濾后的麥芽汁裝入敞口的發(fā)酵瓶中，置于水浴鍋中煮沸90 min，在煮沸10 min時加入酒花。

菌株活化：采用啤酒活性干酵母及實驗室保存的嗜熱鏈球菌進行發(fā)酵。將嗜熱鏈球菌接種到MRS培養(yǎng)基中，按2%（V/V）接種量活化三代至活菌濃度為3×107CFU/mL。啤酒活性干酵母按料水比為1∶10（W/V），加入2%蔗糖，置于35℃水浴鍋中活化30 min至大量起泡即酵母活化完成。

接種：在超凈臺中完成，以防止污染。

發(fā)酵：發(fā)酵瓶用帶有單向閥的瓶蓋密封，置于恒溫培養(yǎng)箱中。

貯存熟化：將發(fā)酵液密封置于4℃冷藏柜7 d。

巴氏殺菌：65～70℃殺菌12～15 min。

1.3.2 藜麥格瓦斯發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

固定初始麥芽添加總量30 g，酒花添加量0.4%，藜麥添加量8%，接種量3%，接種比（酵母菌∶乳酸菌）2∶1，發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時間16 h。分別改變大麥芽與焦香麥芽的比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）、藜麥添加量（0、4%、8%、12%、16%）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、接種比（3∶1、5∶2、2∶1、3∶2、1∶1）、發(fā)酵時間（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）、發(fā)酵溫度（30.0℃、27.5℃、25.0℃、22.5℃、20.0℃），對格瓦斯粗品進行感官評定以確定每個因素的最佳水平。

1.3.3 藜麥格瓦斯發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

表1 藜麥格瓦斯發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of quinoa kvass

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平正交試驗，考察發(fā)酵溫度、接種量、接種比和發(fā)酵時間對格瓦斯感官品質(zhì)的影響，正交試驗因素與水平見表1。

1.3.4 測定方法

感官評價：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16861—1997《感官分析通過多元分析方法鑒定和選擇用于建立感官剖面的描述詞》，選擇描述詞，根據(jù)GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》建立感官評分標(biāo)準(zhǔn)，見表2。選定20人（男女各10人），根據(jù)表2標(biāo)準(zhǔn)主要圍繞色澤、氣泡、口感風(fēng)味和組織狀態(tài)對藜麥格瓦斯進行感官評定。

表2 藜麥格瓦斯感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard of sensory evaluation of quinoa kvass

藜麥格瓦斯中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析采用氣質(zhì)聯(lián)用法，其前處理：精密量取8.0 mL藜麥格瓦斯放入20 mLSPME樣品瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分進行萃取，在60℃水浴條件下平衡10 min，萃取頭頂空吸附30 min后，在GC進樣口釋放1 min。

揮發(fā)性風(fēng)味成分的氣相色譜-質(zhì)譜條件為DB-5毛細色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（He）；載氣流速1.0 mL/min；離子源溫度230℃；進樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度50℃保持1 min，以2℃/min升溫至100℃保持3 min，再以4℃/min升溫至220℃保持10 min，不分流進樣；質(zhì)量掃描范圍（m/z）50～550；溶劑延遲1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥格瓦斯發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 大麥芽與焦香麥芽比例的確定

由圖1可知，在固定初始主原料配比和發(fā)酵條件下，藜麥格瓦斯感官評分隨大麥芽和焦香麥芽的比例升高呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在大麥芽和焦香麥芽的比例為7∶3時感官評分達到最大值85.3分，此時藜麥格瓦斯呈深黃色，且焦香味較好，故大麥芽與焦香麥芽最佳比例確定為7∶3。

圖1 大麥芽與焦香麥芽比例對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.1 Effect of barley malt to burnt malt ratio on sensory evaluation score of quinoa kvass

2.1.2 藜麥添加量的確定

由圖2可知，在其他條件不變情況下，藜麥格瓦斯感官評分隨藜麥添加量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在無藜麥添加時，格瓦斯口感雖均衡，但無特征風(fēng)味，在藜麥添加量為12%時，感官評分達到最大值86.4分，此時藜麥特有的香味豐富，酸甜平衡，故藜麥最優(yōu)添加量確定為12%。

圖2 藜麥添加量對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.2 Effect of quinoa addition on sensory evaluation score of quinoa kvass

2.1.3 接種量的確定

圖3 接種量對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum on sensory evaluation score of quinoa kvass

由圖3可知，在其他條件固定情況下，藜麥格瓦斯感官評分隨接種量的增加整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在接種量為3%時，感官評分達到最大值87.4分，此時藜麥格瓦斯含氣豐富，口感平衡，故最佳接種量確定為3%。

2.1.4 接種比的確定

由圖4可知，在其他條件不變情況下，藜麥格瓦斯感官評分隨酵母菌和乳酸菌的比例減小呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在酵母菌與乳酸菌比例為2∶1時，感官評分達到最大值87.5分，此時藜麥格瓦斯口感均勻，氣味協(xié)調(diào)，故酵母菌與乳酸菌最佳接種比確定為2∶1。

圖4 接種比對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.4 Effect of inoculation proportion on sensory evaluation score of quinoa kvass

2.1.5 發(fā)酵時間的確定

由圖5可知，在其他條件不變情況下，發(fā)酵時間對藜麥格瓦斯感官評分的影響類似于接種比對其的影響。在發(fā)酵16 h時，感官評分達到最大值87.0分，此時藜麥格瓦斯酸甜適口。隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液糖度和酸度下降明顯使黎麥格瓦斯口感較酸，故最佳發(fā)酵時間確定為16 h。

圖5 發(fā)酵時間對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation score of quinoa kvass

2.1.6 發(fā)酵溫度的確定

由圖6可知，在其他條件都確定的情況下，發(fā)酵溫度對藜麥格瓦斯感官評分的影響表現(xiàn)為先升高后下降。在25.0℃時，感官評分達到最大值84.4分，此時藜麥格瓦斯殺口感均勻，且稍有啤酒的香味，因此，確定最佳發(fā)酵溫度為25.0℃。

圖6 發(fā)酵溫度對藜麥格瓦斯感官評分的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation score of quinoa kvass

2.2 藜麥格瓦斯發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

表3 藜麥格瓦斯發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of quinoa kvass

由表3可知，影響藜麥格瓦斯感官評分的因素主次順序為接種量（B）＞接種比（C）＞發(fā)酵溫度（A）＞發(fā)酵時間（D），最優(yōu)工藝組合為A1B1C1D1，即發(fā)酵溫度23℃、接種量2.5%、接種比1.8∶1.0、發(fā)酵時間16 h時，在此優(yōu)化條件下所得藜麥格瓦斯的感官評分為87.4分。

2.3 藜麥格瓦斯的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用HS-SPME結(jié)合GC-MS萃取分離鑒定藜麥格瓦斯中的揮發(fā)性成分，通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫檢索，藜麥格瓦斯的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成見表4。

表4 藜麥格瓦斯中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 4 Analysis results of volatile flavor substances in quinoa kvass by GC-MS

由表4可知，在檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，醇類化合物所占的比例最大，占全部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的65.82%，共有13種，其中苯乙醇含量最高，占總揮發(fā)性物質(zhì)的25.74%，其次是異戊醇，占18.68%。苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香味[15]，異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味[16]，這兩種物質(zhì)在形成藜麥格瓦斯整體風(fēng)味中具有重要作用。

酯類物質(zhì)所占比例僅次于醇類物質(zhì)，占檢出總量的23.09%。共有16種，排在前三的分別為辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯，各自占總揮發(fā)性物質(zhì)的7.78%、3.52%和3.15%。辛酸乙酯具有梨子香味[17]，癸酸乙酯具有椰子香味[18]，正己酸乙酯具有水果香味，能夠起到很好的香氣修飾效果[19]。酯類物質(zhì)整體提供了怡人的果香香氣，可使藜麥格瓦斯變得清甜醇香[20]。

酸類物質(zhì)共檢測到9種，占檢出總量的6.79%，其中正癸酸和辛酸含量較高，分別為2.65%和2.05%。適量的酸可對格瓦斯起緩沖作用，協(xié)調(diào)、烘托格瓦斯的主體香。醛類物質(zhì)共檢測到6種，分別是3,5-二甲基苯甲醛、苯乙醛、異戊醛、椰子醛、壬醛和2-甲基十一醛，其中苯乙醛具有甜香味、壬醛具有玫瑰花香，椰子醛具有苦杏仁或桃花香[21]。另外，還檢測到2種酮類物質(zhì)、1種烴類物質(zhì)和1種酚類物質(zhì)，其中甲基庚烯酮和2-壬酮都具有具有水果香氣，2-甲氧基-4-甲基苯酚具有香辛料、丁香、香蘭素和煙熏香氣。這些物質(zhì)共同組成了藜麥格瓦斯獨特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

采用單因素及正交試驗對以大麥芽、焦香麥芽、藜麥為原料的格瓦斯發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，藜麥格瓦斯最佳發(fā)酵工藝為大麥芽∶焦香麥芽7∶3、藜麥添加量12%、接種量2.5%（V/V）、接種比例（酵母菌∶乳酸菌）1.8∶1.0、發(fā)酵溫度23℃、發(fā)酵時間16 h。在此工藝條件下，得到藜麥格瓦斯飲料顏色呈深黃色、酸甜爽口、風(fēng)味良好，感官評分為87.4分。

利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC-MS）技術(shù)分析藜麥格瓦斯揮發(fā)性風(fēng)味成分，共鑒定出48種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中包括醇類13種（含量65.82%）、酯類16種（含量23.09%）、酸類9種（含量6.79%）、醛類6種（含量1.36%）、烴類1種（含量0.86%）、酚類1種（含量1.57%）、酮類2種（含量0.51%）。藜麥格瓦斯中主要風(fēng)味物質(zhì)為醇類、酯類和酸類。主要風(fēng)味化合物為苯乙醇（25.74%）和異戊醇（18.68%）等。