外源鈣和NO對鹽脅迫下梨保護酶的影響

李俊豪，解 斌，景淑怡，宋宇琴，李六林

(山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西太谷 030800)

梨是中國主栽果樹之一，具有重要經(jīng)濟價值。由于不合理灌溉和施肥等諸多因素，使得土壤次生鹽漬化問題不斷加劇，土壤鹽漬化成為嚴重影響梨產(chǎn)業(yè)正常發(fā)展的主要非生物脅迫之一。

在鹽脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基，從而使植物產(chǎn)生膜質(zhì)過氧化作用，膜透性增加，導(dǎo)致植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打亂，顯著抑制植物的正常生長和發(fā)育[1]。植物在長期進化過程中，相應(yīng)形成了由酶促和非酶促組成的抗氧化防御系統(tǒng)，酶促反應(yīng)系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等保護酶，以減輕或清除ROS的傷害，從而增強植物對逆境脅迫的耐受或抵抗能力[2]。目前研究認為，利用外源物質(zhì)例如鈣和一氧化氮等對栽培作物進行誘抗處理是提高其逆境耐受性的簡便、有效、可行的方法之一[3]。鈣是植物必需的一種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，作為細胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使偶聯(lián)胞外信號，在調(diào)控多種酶活性等過程中均具有重要的作用，外源“補鈣”可以改變植物生長特性。已有研究表明，外源CaCl2可以緩解鹽脅迫[4]、干旱脅迫[5]和病菌侵染[6]等逆境對植物產(chǎn)生的傷害。一氧化氮(NO)也是植物體內(nèi)一種重要的信號分子，具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、參與植物應(yīng)答各種逆境脅迫的生理功能。周萬海等人[7]研究發(fā)現(xiàn)外源SNP處理能明顯緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗根系生長的抑制，李翠芳等[8]研究表明外源SNP能增強葉片抗氧化能力，改善葉質(zhì)。因此，研究鹽脅迫下外源SNP及CaCl2對梨愈傷組織的保護酶系統(tǒng)的調(diào)控作用，對于深入理解梨在生長過程中抵抗逆境、減少活性氧積累的機制具有十分重要的意義。

組織培養(yǎng)具有實現(xiàn)植物遺傳背景一致，生長環(huán)境可控的優(yōu)勢。因此，試驗以組織培養(yǎng)杜梨和雪花梨愈傷組織為材料，研究兩者保護酶系統(tǒng)在響應(yīng)NaCl脅迫時的變化差異，同時使用外源CaCl2和NO處理，測定雪花梨在NaCl脅迫下保護酶的活性變化情況，以期明確CaCl2和NO在提高梨抗鹽性過程中的調(diào)控機制，為外源鈣和硝普鈉(SNP)在逆境緩解效應(yīng)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為杜梨和雪花梨莖段愈傷組織。梨莖段于2017年5月采自山西省農(nóng)科院果樹研究所梨資源圃，并在山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院進行愈傷組織培養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

選擇生長旺盛且均勻一致的杜梨和雪花梨愈傷組織，分別接種于含100 mmol/L NaCl[9]的MS培養(yǎng)基中，每個處理接種30瓶。在NaCl處理的雪花梨愈傷組織培養(yǎng)瓶中，分別外施10 mmol/L CaCl2和一氧化氮供體100 μmol/L硝普鈉(SNP)，每個處理接種30瓶，分別于處理的0、6、12和24 h隨機采樣0.2 g，液氮速凍，保存于零下80 ℃的冰箱中備用。

1.3 測定項目及方法

酶液制備參照安玉艷[10]等的方法，并略作修改：取保存的愈傷組織，液氮研磨，加1.6 mL預(yù)冷的提取液(50 mmol/L，pH 7.8 磷酸緩沖液)，于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶活性：氮藍四唑光還原法測定；過氧化物酶活性：愈創(chuàng)木酚顯色法；過氧化氫酶采用紫外線吸收法測定，具體參照高俊鳳[11]的實驗方法；抗壞血酸過氧化物酶活性參照鄒琦等[12]的方法進行。每個指標重復(fù)測定3次，取平均值。

使用Microsoft Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，使用SAS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對超氧化物歧化酶活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除超氧自由基的關(guān)鍵酶類，可催化O2-生成H2O2和O2[13]。由圖1-A可知，在NaCl處理下，杜梨愈傷組織SOD酶活性呈先升高后降低的趨勢，在處理6 h時達到峰值，約為對照的1.5倍；雪花梨愈傷組織的SOD酶活性隨著NaCl脅迫時間的延長則呈降低趨勢，且均低于對照，在處理24 h時為對照的0.83倍，差異達顯著水平(P<0.05)。

如圖1-A所示，在NaCl處理的同時施以CaCl2和SNP，對雪花梨愈傷組織SOD酶活性影響顯著。外源CaCl2和SNP均能改變SOD酶活性降低的趨勢，但呈現(xiàn)出不同的變化特征。在CaCl2處理組中，雪花梨愈傷組織SOD酶活性呈緩慢上升趨勢，在24 h達到峰值，約為單獨NaCl處理的1.22倍。在SNP處理組中，雪花梨愈傷組織SOD酶活性呈先升高后降低的趨勢，且在6 h時酶活即達到峰值，約為單獨NaCl處理的1.17倍。

通過上述結(jié)果可以看出，在NaCl脅迫下，CaCl2處理和SNP處理均能提高SOD酶活性，與單獨NaCl處理相比，差異顯著。而與CaCl2處理相比，SNP處理能更快激活SOD的酶活性，且酶活更高。說明在NaCl脅迫下，經(jīng)過適當?shù)拟}和SNP處理能使SOD酶的活性增加，進而增強雪花梨對NaCl脅迫的耐受性。

2.2 不同處理對過氧化物酶活性的影響

POD是膜脂過氧化防御系統(tǒng)的主要保護酶，通常用以反映植物抗鹽性強弱[14]。如圖1-B所示，在NaCl處理24 h內(nèi)，杜梨愈傷組織POD酶活性有顯著提高(P<0.05)，且其最大酶活在處理12 h時出現(xiàn)，約為對照處理的2.29倍；隨著NaCl脅迫時間的延長，雪花梨愈傷組織POD酶活性呈降低趨勢，且均顯著低于對照(P<0.05)，在處理12 h時降至對照的0.38倍。表明在NaCl脅迫下，杜梨愈傷組織POD酶能在抗氧化酶系統(tǒng)中起到積極作用，而雪花梨愈傷組織POD酶受到一定程度破壞。

在NaCl處理的同時施以CaCl2和SNP，對雪花梨愈傷組織POD酶活性同樣影響顯著(圖1-B)。在CaCl2處理組中，雪花梨愈傷組織POD酶活性被快速激活，在處理6 h時達到峰值，為對照處理的1.35倍，為單獨NaCl處理6 h時POD酶活的1.97倍，且在處理12 h和24 h時均降低至對照水平，其與CaCl2處理下的SOD酶活相比，表現(xiàn)更為活躍。在SNP處理組中，雪花梨愈傷組織POD酶活性也在處理6 h時出現(xiàn)峰值，約為對照處理的1.33倍。

分析上述結(jié)果可以看出，與單獨NaCl處理相比，外施CaCl2和SNP可以使POD酶活性峰值出現(xiàn)時間提前，均出現(xiàn)在處理后6 h內(nèi)。表明在NaCl脅迫下，兩種外源物質(zhì)處理均可提高POD酶的活性，以此幫助雪花梨盡快適應(yīng)高鹽環(huán)境。

CK表示未經(jīng)NaCl處理的樣本，6、12、24 h表示NaCl處理對應(yīng)時間的樣本；不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著(P<0.05)，圖2同圖1 NaCl脅迫下鈣和一氧化氮對梨愈傷組織SOD酶和POD酶活性的影響Note:CK indicates the samples without NaCl treatment in the figure,6 h,12 h and 24 h indicate the samples with NaCl treatment corresponding treated time; and different lowercase letters show significant difference at 5% level (P < 0.05), the other figures are as same.Fig.1 Effect of calcium and nitric oxide on superoxide dismutase activity andperoxidaseactivity in pear callus under NaCl stress

2.3 不同處理對過氧化氫酶活性的影響

CAT主要存在于乙醛酸循環(huán)體、線粒體和過氧化物體中，是催化并清除H2O2的重要酶類[15]。NaCl處理下杜梨和雪花梨愈傷組織過氧化氫酶活性的變化規(guī)律如圖2-A所示。在NaCl處理下，杜梨CAT酶活性在處理6 h時出現(xiàn)大幅下降，之后顯著升高(P<0.05)，其中在NaCl處理12 h時杜梨愈傷組織CAT酶活性顯著高于對照組和NaCl處理6 h時的酶活性(P<0.05)，分別是2.10倍和5.19倍；在處理24 h時，CAT酶活雖出現(xiàn)下降，但仍顯著高于對照組和處理6 h時的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈傷組織CAT酶活性變化趨勢表現(xiàn)出與杜梨類似的趨勢，在NaCl處理12 h和24 h時，雪花梨愈傷組織CAT酶活性均顯著高于處理6 h時的酶活性，分別達3.22倍和2.52倍，但與對照處理酶活性相比，差異均未達顯著水平(P>0.05)。

在NaCl脅迫條件下，施加CaCl2和SNP的雪花梨愈傷組織與未施加的相比，其CAT酶活性變化存在顯著差異(P<0.05)(圖2-A)。結(jié)果顯示，在外源CaCl2和SNP處理下，雪花梨愈傷組織CAT酶活性被快速激活，在處理6 h時達到峰值，分別為對照處理的1.61倍和1.89倍，另外，分別也為單獨NaCl處理的4.72倍和5.76倍，隨后酶活性呈下降趨勢。CAT酶活性在經(jīng)鈣和一氧化氮處理后發(fā)生明顯改變，表明兩種外源物質(zhì)對雪花梨愈傷組織的CAT酶活性起到明顯促進作用。

圖2 NaCl脅迫下鈣和一氧化氮對梨愈傷組織CAT酶和APX酶活性的影響Fig.2 Effect of calcium and nitric oxide on catalase activity and ascorbate peroxidase activity in pear callus under NaCl stress

2.4 不同處理對抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

APX是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵解毒酶，能夠?qū)2O2分解為H2O。如圖2-B所示，經(jīng)NaCl處理不同時間后，杜梨和雪花梨愈傷組織APX酶活性變化規(guī)律存在顯著差異。在NaCl處理下，杜梨APX酶活性在處理6 h時未有明顯增加，在處理12 h時杜梨愈傷組織APX酶活性顯著高于對照組和處理6 h時的酶活性(P<0.05)，分別是3.51倍和2.55倍，在處理24 h時，APX酶活雖出現(xiàn)下降，但仍顯著高于對照組和處理6 h時的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈傷組織APX酶活性變化趨勢與其SOD酶活性變化一致，在NaCl處理24 h內(nèi)，雪花梨愈傷組織APX酶活性顯著低于對照處理的APX酶活性(P<0.05)。以上結(jié)果說明，APX酶在耐鹽性杜梨適應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮積極作用。

雪花梨愈傷組織在NaCl處理的同時施以CaCl2和SNP與單獨NaCl處理相比，其APX酶活性隨處理時間延長變化趨勢存在差異(圖2-B)。結(jié)果顯示，外源CaCl2和SNP雖均未改變NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織APX酶活性的下降趨勢，但減緩了下降的幅度。在施加CaCl2處理中，NaCl處理6 h時的APX酶活性與對照差異不顯著(P>0.05)，但為單獨NaCl處理的1.72倍；CaCl2處理12 h時的APX酶活性為不加CaCl2的4.9倍。在施加SNP處理6 h和12 h時的酶活性分別為單獨NaCl處理1.29倍和2.87倍。以上結(jié)果證實了在應(yīng)對高鹽環(huán)境時，外源鈣和一氧化氮對雪花梨所受損傷的緩解作用。

3 討論與結(jié)論

在逆境環(huán)境下，需氧生物活性氧代謝失調(diào)引起的自由基積累及自由基對大分子的破壞是植物組織遭受傷害的重要特征。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶等是植物評價抗性的重要指標[16]。馬麗清等[17]對蘋果砧木的研究中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，耐鹽種珠美海棠膜保護酶系統(tǒng)活性較高。研究結(jié)果顯示，杜梨愈傷組織在NaCl脅迫下，具有更加活躍的保護酶系統(tǒng)，而雪花梨的各類保護酶出現(xiàn)了不同程度的下降，說明與雪花梨愈傷組織相比，杜梨愈傷組織具有更強的自我保護機制，以抵抗鹽生環(huán)境的傷害。

Ca2+是一種良好的生物膜保護劑，可以提高抗氧化酶活性，增強清除活性氧自由基的能力；NO作為一種信號分子可以激活抗氧化酶基因表達，能調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)，促進植物的防衛(wèi)反應(yīng)，增強抗逆性[18]。王策等[19]研究表明，10 mM CaCl2處理可通過促進NaCl脅迫下酸棗幼苗植株體內(nèi)抗氧化酶活性的提高，增強植株對NaCl脅迫的適應(yīng)性。王延秀等[20]研究表明，SNP處理能夠激活水分脅迫下楸子幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)，增強其耐旱性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源CaCl2和SNP的施用，雖對APX酶活性的影響不顯著，但可以有效提高鹽脅迫下雪花梨愈傷組織SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，對緩解鹽脅迫影響、促進植株正常生長發(fā)育有重要作用。從酶活變化趨勢看，在外源SNP處理下，NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織SOD、POD和CAT均在處理6 h時顯著上升，之后下降；在外源CaCl2處理下，NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織SOD呈逐漸上升趨勢，而POD和CAT變化波動較大。說明兩種外源物質(zhì)分別參與不同的抗氧化酶調(diào)控機制，緩解鹽脅迫傷害。這一結(jié)果可能與鈣和一氧化氮在植物體內(nèi)所發(fā)揮的信號作用密切相關(guān)，而具體作用機制有待進一步證實。