膠原蛋白膜用于大鼠胃壁缺損修復(fù)的可行性及有效性研究*

翟文斌 趙黎黎 陳穎彤 陳嘉偉 劉 莉 王 敏 王 翔 范志寧

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡科，南京 210029)

醫(yī)源性消化道穿孔是消化內(nèi)鏡檢查及治療過程中一種罕見但危及生命的并發(fā)癥，具有較高的致病率和病死率[1]。外科手術(shù)修補(bǔ)一直是急性消化道穿孔的標(biāo)準(zhǔn)治療方式，但創(chuàng)傷大，并存在術(shù)后吻合口狹窄、吻合口漏或瘺等并發(fā)癥可能。回顧性研究[2,3]表明，外科手術(shù)修補(bǔ)內(nèi)鏡下穿孔并發(fā)癥發(fā)生率為25%～36%，病死率7%～10%。穿孔早期發(fā)現(xiàn)、快速修補(bǔ)、創(chuàng)面快速愈合是改善預(yù)后的重要手段。內(nèi)鏡可快速發(fā)現(xiàn)和修補(bǔ)小穿孔，如鈦夾夾閉、荷包縫合、內(nèi)鏡金屬夾系統(tǒng)(over-the-scope clips,OTSC)縫合、支架植入等[1,4,5]，但僅限于小穿孔。穿孔快速修補(bǔ)和消化道完整結(jié)構(gòu)重建是重要難題。目前常用的方法主要有自體組織移植、異體組織移植及人工合成組織替代品移植。前兩種存在供體嚴(yán)重受限和免疫排斥反應(yīng)等問題，人工合成材料目前是研究熱點(diǎn)。不同材質(zhì)補(bǔ)片用于消化道穿孔修補(bǔ)已取得良好效果，但大多以瘢痕修復(fù)、組織異生為主，新生組織結(jié)構(gòu)和功能難以恢復(fù)[6]。目前，聚乳酸(polylactic acid,PLA)膜配合膠原纖維膠在內(nèi)鏡黏膜下剝離(endoscopic submucosal dissection,ESD)術(shù)后穿孔或預(yù)防ESD術(shù)后遲發(fā)性穿孔方面得到較好的臨床效果[7～9]，但術(shù)后需要禁食和應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑。

引導(dǎo)組織再生(guide tissue regeneration,GTR)膠原蛋白膜是一種獨(dú)特的疏密復(fù)合雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的人造Ⅰ型膠原蛋白膜，目前在骨科、神經(jīng)外科、五官科等手術(shù)中用于促進(jìn)組織修復(fù)和再生[10～12]，取得良好效果，目前在消化道缺損領(lǐng)域尚缺乏相應(yīng)的研究。本研究探討GTR膠原蛋白膜在大鼠胃壁缺損修補(bǔ)的可行性及有效性，并與臨床已在使用的PLA膜進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

33只健康SD大鼠(8周齡，250～260 g)購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(蘇)2018-0020]，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)五臺(tái)校區(qū)動(dòng)物房，室溫25 ℃，濕度10%～20%，每天保持12 h晝夜循環(huán)，自由攝水和飼料。實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-1809024)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。適應(yīng)性飼養(yǎng)4天后進(jìn)行手術(shù)造模，手術(shù)當(dāng)天33只大鼠體重(260.1±2.7)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑和儀器 2%戊巴比妥鈉，2%碘伏，75%乙醇，生理鹽水，4%多聚甲醛，手術(shù)刀，手術(shù)剪，紗布，電刀(桂林市立康電子醫(yī)療設(shè)備有限公司)，GTR醫(yī)用膠原蛋白膜(福建省博特生物科技有限公司)，PLA膜(廣州弘健生物醫(yī)用制品科技有限公司)。

1.2.2 動(dòng)物模型建立及手術(shù)修補(bǔ) 所有SD大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水6 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉。腹部皮膚備皮，取頭高腳低仰臥位(與水平面呈30°角)固定于手術(shù)操作臺(tái)上，消毒，鋪單。劍突下腹部正中切口，逐層切開腹壁2 cm，暴露胃體大彎及胃底，以電刀全層切開胃底近胃體大彎側(cè)，形成7 mm×7 mm胃壁穿孔。實(shí)驗(yàn)組(n=25)以與穿孔相同大小的膠原蛋白膜修補(bǔ)，對(duì)照組(n=8)以PLA膜修補(bǔ)胃壁缺損，均以6-0絲線間斷縫合補(bǔ)片和胃壁，逐層關(guān)閉腹腔。術(shù)后禁水6 h，禁食24 h后恢復(fù)正常飲食。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組大鼠分為5籠飼養(yǎng)，每籠5只；對(duì)照組飼養(yǎng)至術(shù)后6周。

1.2.3 觀察指標(biāo) 術(shù)后每天測(cè)量體重，觀察生命體征及精神狀態(tài)，飲食情況，有無腹脹、腹瀉、腹膜炎發(fā)生。實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后第3天、1周、2周、4周、6周從各籠中抽取1只共5只，2%戊巴比妥鈉5 ml/kg腹腔注射麻醉致死，對(duì)照組于術(shù)后6周同法處死，觀察腹腔粘連情況、胃壁缺損修復(fù)情況，黏膜缺損面積按照缺損部位長徑×短徑×π/4計(jì)算。取出部分新生胃壁及其周圍正常組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度5 μm，HE染色觀察組織的基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)，組織修復(fù)與再生過程中肉芽組織增生、炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞與纖維細(xì)胞增殖、新生血管生成情況。Masson染色觀察組織修復(fù)過程膠原蛋白的增生和沉積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

所有大鼠胃壁穿孔建模和修補(bǔ)術(shù)成功完成。

實(shí)驗(yàn)組25只大鼠術(shù)后生存情況良好，無死亡，無腹脹、腹瀉，無腹膜炎表現(xiàn)，無腹腔膿腫及消化道漏，體重術(shù)后短暫下降后穩(wěn)步上升，生長情況良好，術(shù)后1～6周體重變化見表1。術(shù)后3天，大鼠腹腔未見明顯感染，膠原蛋白膜依然保持良好結(jié)構(gòu)，與正常胃壁組織緊密貼合(圖1A)，無胃內(nèi)容物漏至腹腔。1周以后，所有大鼠胃壁穿孔完全閉合(圖2A)，缺損部位漿膜面與腹壁或腹腔臟器稍有粘連。術(shù)后1周，黏膜面穿孔部位黏膜上皮缺損范圍(39.79±0.55)mm2，未見明顯組織攣縮；術(shù)后2周，缺損面積(7.40±0.43)mm2，術(shù)后4周減至(0.91±0.08)mm2，術(shù)后6周黏膜完全再生(圖2B)，未見明顯瘢痕組織形成，缺損部位漿膜面和腹壁或腹腔臟器均有輕度粘連對(duì)照組大鼠(n=8)術(shù)后3天內(nèi)3只死亡，解剖見穿孔修補(bǔ)部位再次穿孔，大量食物、消化液漏至腹腔；1只腹瀉，1周后恢復(fù)正常，其余4只未見明顯異常，存活率62.5%(5/8)，明顯低于實(shí)驗(yàn)組[100%(25/25)](Fisher檢驗(yàn)，P=0.010)。術(shù)后體重變化見表1，對(duì)照組大鼠體重均低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。術(shù)后6周缺損部位漿膜面和腹壁或腹腔臟器均有輕度粘連，黏膜缺損面積(1.39±0.20)mm2，顯著大于實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周黏膜缺損(0.91±0.08)mm2(t=-5.029，P=0.001)。

表1 2組大鼠術(shù)后體重 g

2.2 組織病理分析

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天見膠原蛋白膜與正常組織緊密貼合，兩者相融，膠原蛋白膜表面大量細(xì)胞爬行及肉芽組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞為主)(圖1B、C、D)；術(shù)后1周，缺損處新生組織表面黏膜缺如，結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，新生毛細(xì)血管形成(圖3B)；術(shù)后2周，新生組織結(jié)構(gòu)紊亂，正常黏膜向缺損部位爬行延展，部分缺損部位黏膜層恢復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增生，新生毛細(xì)血管密度進(jìn)一步增加(圖3A、B)；術(shù)后4周，新生組織黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)一步爬行，黏膜缺損進(jìn)一步減少，成纖維細(xì)胞減少，部分轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞，新生血管結(jié)構(gòu)正常化(圖3A、B)；術(shù)后6周，新生組織黏膜完全再生，黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)顯示清晰，趨于正常化(圖3A、C)，高倍鏡下見成纖維細(xì)胞明顯減少，黏膜下層纖維細(xì)胞排列整齊有序(圖3B)。整個(gè)修復(fù)過程，未見膠原蛋白過度增生，未見明顯纖維化(圖3C)；也未見明顯瘢痕組織增生(圖2B)。

對(duì)照組術(shù)后6周缺損部位新生組織黏膜尚未完全再生，仍有部分缺損，新生部位組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，明顯多于實(shí)驗(yàn)組，大量成纖維細(xì)胞增生，部分新生血管生成，組織再生和修復(fù)程度明顯劣于實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周水平(圖3)。

3 討論

隨著消化內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)(endoscopic mucosal resection,EMR)、內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection,ESD)對(duì)于消化道早癌的微創(chuàng)診治得到廣泛認(rèn)可[4,13～15]，但其并發(fā)癥消化道穿孔卻是臨床上急需解決的難題，目前常用方法為內(nèi)鏡下修補(bǔ)、腹腔鏡或開腹手術(shù)修補(bǔ)等[1,4,5]；穿孔較大或污染較重時(shí)可能需要部分消化道切除或造瘺。

消化道完整結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能重建一直是重大挑戰(zhàn)，各種促進(jìn)組織再生和修復(fù)的材料是目前研究的重點(diǎn)。聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)在1993年首次應(yīng)用于大鼠胃壁缺損修補(bǔ)，成功封堵大鼠胃壁缺損[16]，但主要為組織纖維化異生修補(bǔ)，沒有正常黏膜再生；后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，PTFE修補(bǔ)部分實(shí)現(xiàn)黏膜再生，但新生黏膜非常薄，難以重塑正常功能[17～19]。新型的小腸黏膜下層組織(small intestinal submucosa,SIS)應(yīng)用于大鼠胃壁缺損修補(bǔ)[20]，只實(shí)現(xiàn)了部分黏膜再生。類似研究對(duì)其進(jìn)行功能評(píng)估顯示，6個(gè)月后胃再生部分出現(xiàn)肌肉收縮，伴有完整的黏膜、黏膜下層和肌肉再生[21]，修復(fù)周期較長。Spiliopoulos等[6]用經(jīng)過戊二醛處理的馬的心包組織作為補(bǔ)片修補(bǔ)兔的胃壁穿孔，實(shí)現(xiàn)胃壁穿孔的快速修補(bǔ)，但依然是一種瘢痕修復(fù)，術(shù)后2個(gè)月缺損再生部位都沒有黏膜再生。各種生物材料補(bǔ)片處于不斷研究中，但目前依然沒有完美的材料。PLA膜和纖維蛋白膠目前已在臨床上成功用于ESD術(shù)后穿孔修補(bǔ)或預(yù)防遲發(fā)性穿孔，并取得較好的臨床效果[7～9,22,23]。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[24]。本實(shí)驗(yàn)采用的GTR膠原蛋白膜以牛腱為主原料，通過酶降解法提?、裥湍z原，去除膠原蛋白中的末端抗原肽，有效降低膠原的免疫原性；并經(jīng)過生物改性處理，具有獨(dú)特的雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)降解時(shí)間可控，提高力學(xué)和生物學(xué)性能[25]。本實(shí)驗(yàn)將此膠原蛋白膜與目前已得到臨床應(yīng)用的PLA膜進(jìn)行對(duì)比，探討GTR膠原蛋白膜用于大鼠胃壁修補(bǔ)的可行性及有效性，為GTR膠原蛋白膜輔助內(nèi)鏡下修補(bǔ)消化道穿孔提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因目前內(nèi)鏡下無法實(shí)現(xiàn)致密的連續(xù)縫合，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)腹修補(bǔ)胃穿孔采用疏松的間斷縫合，但實(shí)驗(yàn)組所有大鼠術(shù)后無腹脹、腹瀉及腹膜炎的表現(xiàn)，也未發(fā)生腹腔膿腫或消化道漏，健康狀況良好。對(duì)照組3只大鼠術(shù)后3天內(nèi)再次出現(xiàn)修補(bǔ)部位穿孔，死亡，可能是由于本實(shí)驗(yàn)術(shù)后僅禁食1天，且沒有應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑，PLA膜被胃酸等消化液所腐蝕。臨床上PLA膜用于內(nèi)鏡下修補(bǔ)消化道穿孔或預(yù)防ESD術(shù)后穿孔一般穿孔或創(chuàng)面都比較小，且配合膠原蛋白膠封堵創(chuàng)面，術(shù)后禁食4～7天且常規(guī)應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑，所以取得較好的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后僅禁食1天且沒有應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑的情況下，GTR膠原蛋白膜取得明顯優(yōu)于PLA膜的結(jié)果，說明GTR膠原蛋白膜致密層一側(cè)在激發(fā)自體修復(fù)反應(yīng)過程中能發(fā)揮隔膜屏障作用，保護(hù)缺損組織再生所需要的空間，促進(jìn)損傷區(qū)域早期自我修復(fù)。術(shù)后3天膠原蛋白膜與胃壁貼合(圖1A)，膠原蛋白膜疏松側(cè)大量肉芽組織增生，伴有炎性細(xì)胞浸潤(圖1B、C、D)，說明疏松層一側(cè)可為肉芽組織和微血管的生長提供支架，促進(jìn)組織細(xì)胞增殖和生長因子等局部富集，形成有利于組織再生的微環(huán)境，促進(jìn)組織快速修補(bǔ)，僅1周時(shí)間實(shí)現(xiàn)缺損、穿孔有效閉合，且新生部位黏膜部分再生，至術(shù)后6周缺損部位黏膜完全再生；而對(duì)照組PLA膜修補(bǔ)術(shù)后6周黏膜面依然存在(1.39±0.20)mm2的黏膜缺損，低于實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周水平(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周組織中炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生與新生肉芽組織并存，新生毛細(xì)血管生成，但無炎性細(xì)胞的過度增殖(圖3)。損傷早期的炎癥反應(yīng)是組織修復(fù)所必需的，但過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致炎癥因子大量激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞過度增殖，分泌過多的膠原纖維，進(jìn)而導(dǎo)致瘢痕組織增生[26]，使一期愈合變?yōu)槎谟?，阻礙組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)。此膠原蛋白膜去除了膠原蛋白中的末端抗原肽，有效降低免疫原性，避免免疫和炎癥反應(yīng)過度激活；縱觀整個(gè)修復(fù)過程，既沒有明顯的瘢痕形成及組織攣縮(圖2B)，也沒有膠原蛋白過度增生，無明顯纖維化(圖3C)。說明膠原蛋白膜在促進(jìn)組織修復(fù)和再生過程中并不完全依靠炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增殖及其分泌的膠原纖維實(shí)現(xiàn)修補(bǔ)，GTR膠原蛋白膜的生物學(xué)特性及其特殊結(jié)構(gòu)在修復(fù)過程中也扮演重要角色。術(shù)后6周新生部位黏膜、黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)趨于正?；?圖3)，此膠原蛋白膜不僅實(shí)現(xiàn)穿孔快速修補(bǔ)，還促進(jìn)組織再生和結(jié)構(gòu)恢復(fù)。而對(duì)照組術(shù)后6周新生部位組織結(jié)構(gòu)依然紊亂，炎性細(xì)胞大量浸潤(圖3)。

綜上，GTR膠原蛋白膜獨(dú)特的雙層結(jié)構(gòu)能夠快速封堵缺損部位，促進(jìn)組織再生，重建消化道完整結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，效果明顯優(yōu)于PLA膜。該類材料將為難治性消化道瘺的快速康復(fù)帶來希望。