水產(chǎn)品中砷形態(tài)分析研究進(jìn)展

湯施展，陳中祥，黃曉麗，王海濤，吳松，高磊，黃麗，王鵬

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

砷（俗稱砒）是環(huán)境中最常見有毒物質(zhì)。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將砷和無機(jī)砷化合物列為一類致癌物。水產(chǎn)品中砷化合物主要為亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜堿（AsB）和砷膽堿（AsC）。不同形態(tài)砷的毒性不同，無機(jī)態(tài)的亞砷酸鹽和砷酸鹽毒性較大，為公認(rèn)的致癌物質(zhì)，有機(jī)態(tài)的一甲基砷化物和二甲基砷酸毒性較小，但亦為明確的致癌物，砷甜菜堿和砷膽堿常被認(rèn)為是無毒[1]。受設(shè)備及方法的限制，通常檢測的多為總砷的含量。近年來對不同形態(tài)砷的生物毒性效應(yīng)的研究表明，此前被認(rèn)為是無毒或低毒的有機(jī)形態(tài)砷，生物毒性不容忽視，而且在生物體內(nèi)不同形態(tài)的砷也可以相互轉(zhuǎn)化。結(jié)合砷的總量分析和形態(tài)分析，開展砷毒性機(jī)制和風(fēng)險評估的研究受到廣泛關(guān)注。經(jīng)過多年的發(fā)展研究，該研究領(lǐng)域已經(jīng)涵蓋砷的毒性、污染現(xiàn)狀、富集轉(zhuǎn)化規(guī)律，并建立了一系列靈敏、準(zhǔn)確的砷形態(tài)分析方法。

1 砷的毒性研究

廣泛存在于環(huán)境中的砷的毒性因形態(tài)和化合物溶解度不同差別很大。大部分有機(jī)砷的毒性較弱，單質(zhì)砷在環(huán)境中的溶解度低，毒性也不大，但是，無機(jī)砷化合物的毒性較為劇烈，已引起廣泛關(guān)注[2]。1980年IARC已肯定攝入無機(jī)砷可引發(fā)皮膚癌，對肝臟、生殖系統(tǒng)和機(jī)體酶系統(tǒng)都有不同程度的毒性作用。三價砷As（Ⅲ）和五價砷As（Ⅴ）的毒性高，痕量即使鼠在96h內(nèi)半致死性中毒；而一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）具有中等毒性，砷甜菜堿基本無毒性[3,4]。據(jù)報道，直接接觸有毒砷化物可以產(chǎn)生急性炎癥、出血和壞死，進(jìn)入機(jī)體后可使細(xì)胞內(nèi)酶失活，干擾新陳代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；DMA的細(xì)胞毒性與砷酸鹽和亞砷酸鹽的毒性相似，而MMA的細(xì)胞毒性很弱[5]。砷甜菜堿是目前為止發(fā)現(xiàn)的海洋動物體內(nèi)最主要的砷形態(tài)，通常占可提取砷的 80%，濃度約為 1～300μg·kg-1。研究表明，砷甜菜堿具有較高的生物可利用性，海洋動物體內(nèi)砷主要以此形態(tài)存在[6]。隨著砷形態(tài)檢測技術(shù)的發(fā)展，最近在淡水動物（如魚）體內(nèi)檢出了低濃度的砷甜菜堿。水生生物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了砷膽堿，但濃度低于砷甜菜堿。體外試驗發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉對小鼠骨髓細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性；AsB明顯增強(qiáng)骨髓細(xì)胞活性；小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)72h后，AsB提高了骨髓中大型成熟細(xì)胞數(shù)。然而，迄今在克隆實驗中并未發(fā)現(xiàn)AsB引起骨髓細(xì)胞增殖[5,7]，也沒有胚胎毒性[8]，鼠口服砷甜菜堿的急性 LD50大于 10g·kg-1[9]。金亞平等[10]等研究發(fā)現(xiàn)，接觸 25μmol·L-1的 As（Ⅲ）或 100μmol·L-1的 As（Ⅴ）對原代培養(yǎng)的 Wister大鼠腦組織星型膠質(zhì)細(xì)胞即可產(chǎn)生明顯的毒性損傷；相同條件下MMA和DMA對原代培養(yǎng)星型膠質(zhì)細(xì)胞無明顯的直接毒性作用。秦志峰等[11]研究了亞砷酸鈉對人淋巴細(xì)胞遺傳物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的亞砷酸鈉對人淋巴細(xì)胞微核率、染色體畸變率和姊妹染色體互換率的影響顯著高于對照組。砷的甲基化代謝物（尤其是DMA）也具有細(xì)胞毒性[12]。DMA染毒后可使小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂指數(shù)明顯上升，DNA單鏈斷裂。體外試驗證實，損傷DNA的主要物質(zhì)是DMA的進(jìn)一步代謝產(chǎn)物二甲基胂化物。它與分子氧反應(yīng)形成活性氧參與DNA的損傷形成。DMA能誘導(dǎo)巨核細(xì)胞凋亡，不能被抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD）和過氧化氫酶（CAT）阻斷，而谷胱甘肽（GSH）卻能增強(qiáng)DMA的細(xì)胞毒性。

2 水產(chǎn)品中砷的污染現(xiàn)狀

目前，水產(chǎn)品中砷化合物的污染較為常見。Dabeka等[13]采集了加拿大6個城市的食品，分析發(fā)現(xiàn)砷的濃度范圍在0.1～4 830μg·kg-1。魚類砷平均含量最高，為1 662μg·kg-1，肉和家禽為24.3μg·kg-1，面包和谷物為 24.5μg·kg-1，脂肪和油為19μg·kg-1。加拿大人平均每日攝入總砷量為38.1μg，1～4 歲 組 為 14.9μg，20～39 歲 男 性 為59.2μg。Han等[14]評估臺灣主要海產(chǎn)品食用風(fēng)險時發(fā)現(xiàn)，牡蠣Ostrea gigas的銅、鋅、砷含量在各種海產(chǎn)品中最高。用139 g·d-1的牡蠣個體最大的消費率計算目標(biāo)的危害商數(shù)有機(jī)砷為1.61。無機(jī)砷可能導(dǎo)致終生致癌風(fēng)險，馬群島居民消費牡蠣的無機(jī)砷風(fēng)險估算為5.10×10-4，長期食用牡蠣對一些高危人群可能是危險的。當(dāng)牡蠣體內(nèi)砷的殘留水平在5.6～7.6μg·kg-1（濕重）時即達(dá)到衛(wèi)生防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)上限。黃宏瑜等[15]研究珠海市近海水域海、淡水水產(chǎn)品重金屬污染狀況時發(fā)現(xiàn)，淡水魚有毒元素含量較低，甲殼類和貝類砷含量超標(biāo)率高。采用高效液相色譜串聯(lián)電感耦合等離子體質(zhì)譜法可測出鯖Pneumatophorus japonicus和鯡Clupea pallasi中痕量的DMA；高效液相色譜串聯(lián)配有氫化物發(fā)生器的原子熒光法也可檢出中國對蝦Penaeus orientalis的DMA含量，但在鱈Gadus macrocephalus、褐牙鲆Paralichthys olivaceus、黑線鱈 Melanogrammus aeglefinus、鰈Pleuronectidae等通過上述兩種技術(shù)均未檢測到[16,17]。

國內(nèi)學(xué)者廣泛研究了水產(chǎn)品中總砷和不同形態(tài)砷的含量（表1）。覃東立等[18]對東北三省9個市縣 45家漁場的鯉 Cyprinus carpio、草魚Ctenopharyngodon idellus和鯽Carassius auratus共計177個樣品的分析發(fā)現(xiàn)，砷元素在不同魚類肌肉中殘留量變化在nd～0.534mg·kg-1（濕重）之間，平均含量為0.084mg·kg-1（濕重），低于限量標(biāo)準(zhǔn)。值得關(guān)注的是，不同種類的魚體肌肉中As含量不同，其中含量較高的已超出國家水產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)。遠(yuǎn)洋漁業(yè)公司提供的南極磷蝦油中總砷含量較高，多以AsB形態(tài)賦存；廣州市貨貝Monetaria moneta、金線魚Nemipterus virgatus和魷Ommastrephes bartrami及汕頭市養(yǎng)殖蝦中均檢出As（Ⅴ），潛在食用風(fēng)險需引起重視。

表1 不同地區(qū)和不同水產(chǎn)品中各種形態(tài)砷的含量Tab.1 The contents（mg·kg-1）of different arsenic forms in different fishery products collected from various regions

近幾年，對砷的存在形態(tài)決定其生物毒性和化學(xué)毒性的認(rèn)識不斷加深，用砷的總含量來評價砷對環(huán)境和生物的污染不能如實反映砷的污染現(xiàn)狀，應(yīng)對其進(jìn)行具體的形態(tài)分析和毒性效果評估。

3 砷在生物體內(nèi)的富集與轉(zhuǎn)化研究

目前廣泛研究了不同生物，包括原核生物如細(xì)菌、真核生物如酵母、哺乳動物和高等植物對砷的富集以及相應(yīng)的解毒機(jī)制。三價和五價砷化合物均可從消化道和呼吸道進(jìn)入體內(nèi)，被腸道和肺部吸收。機(jī)體消化系統(tǒng)和酶系統(tǒng)對其富集轉(zhuǎn)化后，毒性較強(qiáng)的五價砷化合物先被還原成三價砷化合物，然后經(jīng)過甲基化逐漸聚集在腎臟和腸道緩慢排出。形成的甲基化砷化合物一般毒性和活性較低，無機(jī)砷化合物更容易由尿排出，還有一部分則以膽汁和汗液的形式排出體外。在此過程中，五價砷化合物還原是機(jī)體砷代謝的第一步，一般三價砷毒性高于五價砷，因此，這一步常被看作是機(jī)體砷化物的致毒過程[22]。砷的毒性及其致癌風(fēng)險也與此關(guān)系密切。機(jī)體內(nèi)砷化合物的代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基能夠激發(fā)層疊的毒性效應(yīng)[23]，砷的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律、解毒機(jī)理和砷化物毒性鈍化技術(shù)的研究值得廣泛關(guān)注。砷進(jìn)入植物體內(nèi)后，也有相應(yīng)的解毒機(jī)制。五價砷通過與磷酸鹽相似的離子通道從細(xì)胞中排出，而三價砷則可直接排出，排出速率與細(xì)胞膜上質(zhì)子梯度相關(guān)[24]。研究證實，淡水綠藻可以迅速將體內(nèi)五價砷轉(zhuǎn)化成二甲基砷化物和砷糖類等物質(zhì)[25]，這對水體中砷化物的降解有重要意義。急性毒性試驗發(fā)現(xiàn)，三價砷對大型水蚤Daphniamagna的24h EC50為2.7mg·L-1[26]。靜脈注射砷酸鹽和亞砷酸鹽后，用液相色譜串聯(lián)原子熒光法檢測給藥鼠、豚鼠和兔膽汁和尿液中砷及其代謝產(chǎn)物含量，未發(fā)現(xiàn)豚鼠進(jìn)行無機(jī)砷甲基化；以砷酸鹽染毒時，砷化物大部分經(jīng)腎臟以尿液的形式排出體外；染毒試驗發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鹽的代謝途徑主要為膽汁，在2 h代謝中以MMA形式排泄出所給劑量8%左右的污染物[27]。

大多數(shù)魚類包括一些淡水魚類，對砷化物具有一定的生物富集性。如在被砷污染的Txeoma湖底泥中，砷含量達(dá)到209 ng·kg-1（干重），生活在湖中的魚體內(nèi)平均砷含量達(dá)到34.0 ng·kg-1（濕重）[28]；Davis[29]等研究了底質(zhì)中的砷在魚體內(nèi)的生物富集規(guī)律，發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)的砷含量與底質(zhì)中砷含量密切相關(guān)。澳大利亞胭脂魚Myxocyprinus asiaticus各組織內(nèi)砷含量顯著不同，主要富集在肝臟，含量達(dá)到19.2 ng·kg-1（干重）[30]。Mormede等[31]研究了深海魚體內(nèi)砷的富集規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其累積和分布規(guī)律與魚的種類關(guān)系密切，且差異較顯著；對體內(nèi)砷化合物毒性的研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉和砷酸鈉對青鳉Oryzias latipes的LC50分別為14.6mg·L-1和30.3mg·L-1。機(jī)體內(nèi)砷化物的富集程度與亞砷酸鈉濃度呈正相關(guān)，只有少量的砷甲基化，更多的砷化物被機(jī)體代謝出體外[32]。孫永學(xué)等[33]利用洛克沙胂脅迫鯽，進(jìn)行富集試驗，發(fā)現(xiàn)洛克沙胂在鯽各組織內(nèi)的殘留多在第3d達(dá)到平穩(wěn)水平，內(nèi)臟中砷的殘留量最高達(dá)30.25mg·kg-1，15d后肌肉中砷的含量已低于0.5mg·kg-1；轉(zhuǎn)入清水后，砷含量迅速下降，24h后即消除完全。

4 不同形態(tài)砷的分析方法

目前，砷化物的形態(tài)分析中大部分采用高效液相色譜與原子熒光光譜、原子吸收光譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[34-36]。在單元素定量分析中，原子吸收光譜法選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，已應(yīng)用于不同類型研究領(lǐng)域，發(fā)展較為成熟；原子吸收光譜往往需要借助色譜分離技術(shù)才能更好地分析元素砷。液相色譜串聯(lián)原子吸收光譜法直接測定砷化物形態(tài)噪聲干擾大，檢出限高，但是，利用氫化物發(fā)生裝置將不同形態(tài)砷化物經(jīng)硼氫化鉀還原為共價氣態(tài)氫化物可優(yōu)化其靈敏度[37]。研究表明[38-41]，高效液相色譜-氫化物生成-原子吸收聯(lián)用系統(tǒng)測定環(huán)境、地下水和食品中不同形態(tài)砷化物可以滿足痕量分析需求。但是，隨著分析儀器的不斷發(fā)展和分析技術(shù)的更新，人們開始更多關(guān)注靈敏度更高、抗干擾能力更強(qiáng)、運行維護(hù)費用更低廉的儀器。

高效液相色譜串聯(lián)電感耦合等離子體質(zhì)譜在砷形態(tài)分析中有明顯優(yōu)勢，但儀器配備率較低和維護(hù)費用成本高，使其難以普及應(yīng)用。氫化物發(fā)生原子熒光光譜測定砷的檢出限低、穩(wěn)定性好、耗時短、成本低廉，優(yōu)于其他分析儀器。用不同前處理方式后可以用液相色譜串聯(lián)原子熒光法測定超痕量的砷形態(tài)。Van Elteren等[42]采用HPLC-HG-AFS聯(lián)用系統(tǒng)，基于選擇性共沉淀技術(shù)HPLC-HG-AFS，使礦泉水中 As（Ⅲ）和 As（Ⅴ）的檢出限達(dá) 0.05μg·L-1。Bohari等[43]利用氣-液分離裝置顯著提高了液相色譜串聯(lián)原子熒光法在天然淡水樣品中的砷形態(tài)分析檢出限，水樣中通常遇到的四種砷化物As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA和DMA檢出限達(dá)到0.05～0.07μg·L-1。

水產(chǎn)品中砷形態(tài)分析方法的研究主要集中在樣品砷形態(tài)提取效率和儀器條件優(yōu)化等。Guo等[44]利用液相色譜串聯(lián)原子熒光法，在超聲時間（60min）、超聲溫度（60℃）、鹽酸濃度（5mol/L）下提取新疆額爾齊斯河水域魚體中無機(jī)砷，As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的檢出限均為0.02mg·kg-1。其中，白斑狗魚Esox lucius As（Ⅲ）含量為 0.071mg·kg-1，鯉 As（Ⅲ）含量為 0.082mg·kg-1，河鱸 Perca fluviatilis As（Ⅴ）含量為 0.051mg·kg-1。Yang等[45]采用液相色譜串聯(lián)原子熒光法分析市售海產(chǎn)品中四種形態(tài)砷化物含量。結(jié)果表明，As（Ⅲ）的檢出限為0.02mg·kg-1，MMA、DMA和 As（Ⅴ）的檢出限均為 0.03mg·kg-1。所檢測的海產(chǎn)品中總砷含量很高，但多以毒性較弱的有機(jī)砷為主，無機(jī)砷含量很低。Shang等[46]利用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定海藻食品中三價砷化合物的含量，優(yōu)化了萃取劑的濃度、提取時間和儀器條件，發(fā)現(xiàn)在0.10mg·kg-1和1.0mg·kg-1添加水平下As（Ⅲ）的平均回收率在92%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%，具有較高的精度。

HPLC-HG-AFS聯(lián)用系統(tǒng)可以滿足多形態(tài)砷化合物的分析，還可靈敏地分析一些重要的砷代謝中間體。利用離子對色譜50℃下恒溫分離，可以成功分析砷代謝中間產(chǎn)物一甲基亞砷酸MMA和二甲基亞砷酸DMA。Cullen等[47]采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法對砷化合物進(jìn)行色譜分離研究，發(fā)現(xiàn)人體尿液中存在MMA。一般認(rèn)為，MMA是砷的生物甲基化代謝的關(guān)鍵中間體，其中涉及由五價甲基氧化加成逐步還原成三價砷。As（Ⅲ）、MMA、DMA和As（Ⅴ）在5min之前完全出峰，可作為快速定量檢測痕量砷形態(tài)化合物的有效手段，也可為研究砷在機(jī)體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化機(jī)制提供技術(shù)支持。

高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法是基于氫化物發(fā)生提高砷形態(tài)分析靈敏度的方法，對于基質(zhì)復(fù)雜、不易產(chǎn)生氣態(tài)氫化物的砷形態(tài)化合物，可采用在線消解裝置進(jìn)行在線消解，將其降解為簡單砷形態(tài)化合物，產(chǎn)生氣態(tài)氫化合物，拓展原子熒光分析測定范圍，靈敏地分析砷膽堿、砷甜菜堿、四甲基砷離子和砷糖等復(fù)雜砷化合物[48-51]。

5 展望

砷的形態(tài)研究在未知砷形態(tài)化合物的鑒定、篩查、砷的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律和與機(jī)體酶系統(tǒng)相互作用的毒理學(xué)機(jī)制研究、脫砷技術(shù)的研究等方面都將成為今后的發(fā)展方向。以不同形態(tài)的砷含量評價水產(chǎn)品中砷的環(huán)境健康效應(yīng)比用砷總量評價更科學(xué)。研究魚體內(nèi)砷的富集規(guī)律與形態(tài)轉(zhuǎn)化機(jī)制，可為水產(chǎn)品中砷限量標(biāo)準(zhǔn)的修訂和水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為推測砷的生物地球化學(xué)循環(huán)與人體健康關(guān)系、砷在生物體內(nèi)的吸收及代謝機(jī)制以及減少砷在水生生物中的積累，控制其在食物鏈中的傳遞提供數(shù)據(jù)支撐和理論參考。