新疆地區(qū)不同綿羊品種支原體肺炎血清學調(diào)查

倪文浩 ，趙亞南 ，劉宜勇 ，吐來力江·哈木太 ，艾爾肯·艾沙 ，買力肯 ，曹 妍 ，瑪依拉 ，陳 磊 *，李文蓉 *

（1.石河子大學動物科技科學院，新疆 石河子 832003；2.新疆畜牧科學院生物技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830026；3.新疆巴音郭楞蒙古自治州種畜場，新疆 博湖縣 841400；4.新疆伊犁州畜牧總站，新疆 伊寧 835000）

綿羊肺炎支原體（Mycop1asma ovipneumoniae of sheep）是引起綿羊或者山羊傳染性胸膜肺炎又叫做綿羊支原體肺炎（Mycop1asma ovipneumoniae，MO）的病原體[1]。該病原體屬于原核生物界支原體科支原體屬，1963年首次由Mackay從綿羊體內(nèi)分離得到，其后Cottew也在患間質(zhì)性肺炎的澳大利亞綿羊肺臟中發(fā)現(xiàn)該病原，1972年Carmichea1等人證明了這種支原體的致病性[2]，并命名為綿羊肺炎支原體。該病多發(fā)生在枯草的冬季和早春季節(jié)，此時羊只因營養(yǎng)缺乏，機體抵抗力普遍降低，容易受寒感冒，羊只因此容易患支原體肺炎，且發(fā)病后致死率也很高。由于本病感染后常呈慢性表現(xiàn)，羊只即使康復也可長期帶菌，造成該病的控制和消滅比較困難。近年來，隨著新疆地區(qū)舍飼生產(chǎn)方式推廣、集約化養(yǎng)殖技術(shù)廣泛應用及各種國外綿羊新品種的引進[3]，加之新疆地區(qū)氣候特點、規(guī)?；驁鲆蜓蛉焊叨燃酗曫B(yǎng)及羊群活動范圍限制等因素，綿羊支原體肺炎的發(fā)病率和致死率有所上升，該病已成為危害綿羊養(yǎng)殖業(yè)的重要因素之一，對畜牧業(yè)發(fā)展造成了巨大經(jīng)濟損失。

綿羊支原體肺炎常呈現(xiàn)地域流行性，病原體主要通過飛沫傳播，在寒冷潮濕、雨水不斷、羊群擁擠、密集等環(huán)境因素下，對呼吸道的感染率較高[4]。1982年，胡景韶等人首次從國內(nèi)發(fā)病綿羊體內(nèi)分離到了該支原體，隨后寧夏和新疆等地也分離到了該病原[5]。2005年以來，陶岳等開展了對新疆北疆石河子、沙灣、昌吉、奇臺等地區(qū)綿羊肺炎支原體的血清學調(diào)查表明，綿羊肺炎支原體在上述地區(qū)廣泛存在[6-10]，嚴重影響當?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展。為了解近年來綿羊肺炎支原體在新疆南北疆地區(qū)不同綿羊品種中的感染情況，2018年，我們采集了新疆伊犁與巴州地區(qū)未免疫MO疫苗的4種綿羊品種血清樣本進行血清MO抗體和抗原成分的檢測及分析，為新疆地區(qū)綿羊支原體肺炎的防控提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

綿羊肺炎支原體抗體（Sheep MP Ab，以下簡稱MP-Ab）、綿羊肺炎支原體抗原（sheep MP Ag，以下簡稱MP-Ag）ELISA試劑盒購自TSZ（美國），離心機購自德國艾本德，ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司，3001-1311型酶標儀購自賽默飛世有限公司；DHP-420恒溫培養(yǎng)箱購自北京市永光明醫(yī)療器械廠，其他所用試劑耗材（如采血管等）均為國產(chǎn)試劑。

1.2 血樣收集與處理

2018年4月至5月在新疆伊犁和巴州地區(qū)兩個規(guī)?；驁觯S機采集2～3歲年齡綿羊血清，共1 628份（樣品信息參見表1）。使用非抗凝真空采血管采集新鮮靜脈液，于4℃冰箱靜置30 min，待其自然凝集，收集析出上清。將其中溶血現(xiàn)象血液樣品進行離心10 min（3 000～4 000 r/min），仔細收集上清。收集的血清進行標記、記錄羊號，而后放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Sheep MP抗原抗體ELISA檢測

1.3.1 Sheep MP抗體檢測

參照Sheep MP Ab試劑盒說明書進行血清MO抗體水平的定性定量分析：該試劑盒采用間接ELISA方法，用MO抗原包板。具體操作：將樣品對應微孔按序編號，每板設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性標準對照、陽性標準對照50 μL。然后在待檢樣品孔中依次分別加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測血清樣品。輕輕搖勻，蓋上封板膜，置于37℃溫箱培養(yǎng)箱孵育30 min。隨后揭開封板膜，甩干液體，拍干后用30倍稀釋的洗液洗滌，重復洗滌5次。加入酶標二抗50 μL后，再次放置溫箱溫育30 min。孵育后的洗滌步驟同上。接著，每孔現(xiàn)加入顯色劑A 50 μL、再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃溫箱內(nèi)避光顯色15 min。最后，每孔加入終止液50 μL，終止反應。將酶標版放置至450nm波長酶標儀中測定OD450nm值。結(jié)果判定：試驗的有效性為設(shè)置陽性對照孔平均值≥1.00，設(shè)置陰性對照平均值≤0.10；臨界值=設(shè)置陰性對照孔平均值+0.15。其中，樣品OD值＜臨界值(CUT OFF)者為綿羊肺炎支原體(MO)陰性，樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為MO陽性。

1.3.2 Sheep MP抗原檢測

參照Sheep MP Ag試劑盒說明書進行血清MO抗原水平的定性定量分析：該試劑盒采用雙抗體夾心ELISA方法，用MO抗體包板。具體操作：將樣品對應微孔按序編號，每板設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性標準對照、陽性標準對照抗原50 μL。然后在待檢樣品孔中依次分別加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測（抗原）血清樣品。輕輕搖勻，蓋上封板膜，置于37℃溫箱培養(yǎng)箱孵育30 min。隨后揭開封板膜，甩干液體，拍干后用30倍稀釋的洗液洗滌，重復洗滌5次。加入酶標抗體50 μL后，再次放置溫箱溫育30 min。孵育后的洗滌步驟同上。接著，每孔現(xiàn)加入顯色劑A 50 μL、再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃溫箱內(nèi)避光顯色15 min。最后，每孔加入終止液50 μL，終止反應。將酶標版放置至450nm波長酶標儀中測定OD450nm值。結(jié)果判定：試驗的有效性為設(shè)置陽性對照孔平均值≥1.00，設(shè)置陰性對照平均值≤0.10；臨界值=設(shè)置陰性對照孔平均值+0.15。其中，樣品OD值＜臨界值(CUT OFF)者為綿羊肺炎支原體(MO)陰性，樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為MO陽性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗進行差異顯著性比較，以P＜0.05表示差異顯著，用不同小寫字母表示；以P＜0.01表示差異極顯著，用不同大寫字母表示。

2 結(jié) 果

2.1 血樣收集

采集的新疆伊犁和巴州地區(qū)規(guī)?；驁鼍d羊血清共1 628份，見表1。

表1 新疆伊犁地區(qū)和巴州地區(qū)規(guī)?；驁鼍d羊血清樣品情況

2.2 Sheep MP抗原、抗體ELISA檢測結(jié)果

新疆伊犁和巴州地區(qū)羊場不同綿羊品種血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA檢測結(jié)果如表2所示，不同地區(qū)綿羊品種間均檢測到MP-Ag和MP-Ab。其中，伊犁地區(qū)MP-Ag平均陽性率20.29%與MP-Ab平均陽性率16.62%均高于巴州地區(qū)MP-Ag平均陽性率14.42%與MP-Ab平均陽性率14.65%，但差異不顯著（P＞0.05)。伊犁地區(qū)哈薩克羊、薩福克羊的MP-Ag陽性率分別為20.04%、20.61%，巴州地區(qū)巴音布魯克羊、杜泊羊、薩?？搜騇P-Ag陽性率分別為17.91%、11.08%、14.70%，同一地區(qū)不同綿羊品種的MP-Ag陽性率雖有差異，但差異不顯著。 伊犁地區(qū)哈薩克羊MP-Ab陽性率23.22%極顯著高于薩?？搜騇PAb陽性率8.30%（P＜0.01)，巴州地區(qū)巴音布魯克羊MP-Ab陽性率18.65%顯著高于杜泊羊MP-Ab陽性率11.08%（P＜0.05），也高于薩福克羊MP-Ab陽性率13.32%，但差異不顯著（P＞0.05）。說明不同綿羊品種之間MP-Ab檢出陽性率存在差異。

表2 伊犁、巴州地區(qū)羊場不同品種綿羊血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA檢測結(jié)果

3 討 論

綿羊支原體肺炎是由肺炎支原體感染而誘發(fā)的一種急性、熱性和高度傳染性的疾病，其臨床特征是高熱、咳嗽，肺和胸膜發(fā)生漿液性及纖維素性炎癥[11]。除急性發(fā)病外，該病原可長期存在于動物體內(nèi)，導致部分病羊漸進性消瘦，懷孕母羊感染還易引發(fā)流產(chǎn)，羔羊感染死亡率較高。綿羊肺炎支原體流行廣泛，致病力強，病羊是主要傳染源。病原體主要通過呼吸道分泌物排出體外，經(jīng)空氣-飛沫傳播[12]，耐過病羊在相當長時間內(nèi)帶毒，有傳播病原的危險性。由于該病對青霉素類藥物具有抗性，且容易對四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥性，所以對綿羊支原體肺炎的抗生素治療效果不佳。此外，綿羊支原體疫苗的保護作用較弱[13]，對該病的防控帶來很大困難，對養(yǎng)羊業(yè)危害嚴重。

綿羊肺炎支原體是國內(nèi)綿羊、山羊和大角羊最常見的分離病原體之一，可引起羊的原發(fā)性非典型肺炎[14]。Rong et a1.(2014)通過綿羊肺炎支原體血清學調(diào)查研究了中國熱帶地區(qū)的山羊，檢出陽性率高達31.7%[15]，青海省（2009年）陽性率 30.40%。在本研究中，對新疆伊犁、巴州地區(qū)不同綿羊品種進行血清學檢測，調(diào)查了綿羊支原體肺炎感染情況，結(jié)果顯示綿羊支原體肺炎的總抗體陽性率平均達到15.54%。這與李劼等報道的新疆石河子地區(qū)（2005年）湖羊MO抗體陽性率 77.90%、新疆阿勒泰（2012年）陽性率22.20%相比，抗體陽性率較低。一方面，這可能是外來引進綿羊適應新疆環(huán)境的能力較弱，感染該病且發(fā)病致死率高，不同年齡的羊只感染該病的情況不同有關(guān)，本研究所涉及羊只均為2～3歲齡的成年羊。解慧梅等[16](2015)對泰州地區(qū)36家羊場開展綿羊支原體肺炎流行病學調(diào)查，得到3月齡以下的羔羊發(fā)病率為45%、致死率為95%，明顯高于其它年齡階段的羔羊、成年羊。馬玉等[17]（2015）對沙灣縣調(diào)查的7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的18個綿羊養(yǎng)殖場中，0～3月齡羔羊的臨床疑似綿羊支原體肺炎所占比例最高達68.57%，明顯高于3～12月齡（27.78%）和12月齡以上（19.66%）的綿羊。本研究的血清樣品為2～3歲齡的成年羊，其抗體檢出陽性率為8.30%～23.22%，與馬玉對沙灣縣12月齡以上綿羊MP抗體陽性檢出率19.66%的研究結(jié)果相似。不同年齡階段的綿羊?qū)d羊支原體肺炎的感染率不同，也說明防治綿羊支原體肺炎在羔羊時期應早發(fā)現(xiàn)早治療。

張道永等[18]（1998）在羊霉形體的研究中提到，不同品種的羊?qū)d羊支原體肺炎的易感性差異較大，進口種羊比本地羊易感。馬玉等[18]對新疆沙灣縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)綿羊養(yǎng)殖場進行了血清MO抗體水平檢測，得出湖羊抗體陽性率（85.71%）遠高于阿勒泰羊（48.15%）和小尾寒羊（57.14%）。Chen C等采用間接血凝測定法分析了中國新疆六個地區(qū)四個不同品種羊（哈薩克羊、湖羊、美利奴羊和多浪羊）1 679份血清等樣本，結(jié)果表明四個品種綿羊的抗體陽性率在9.76%和30.61%之間，湖羊明顯高于其他品種。本次試驗中，伊犁地區(qū)MP-Ab平均陽性率16.62%高于巴州地區(qū)MP-Ab平均陽性率14.65%，但差異不顯著（P＞0.05)；綿羊品種間MP-Ab檢出的陽性率存在顯著性差異，分別在南北疆選擇的兩個試驗點的不同品種間MP-Ab檢出的陽性率均呈現(xiàn)顯著性差異。哈薩克羊與巴音布魯克羊為新疆本地綿羊品種，杜泊羊與薩?？搜驗橥鈦硪M品種。在本地品種MP-Ab檢出的陽性率均顯著高于相同羊場飼養(yǎng)的外來引進品種，即哈薩克羊23.22%vs薩福克8.3%（P＜0.01）、巴音布魯克羊18.65%vs杜泊羊11.08%(P＜0.05)(表2)。盡管感染支原體量的多少、感染時間的長短、所處病理時期等因素均可能影響MP-Ab水平，對MP-Ab檢出結(jié)果產(chǎn)生一定偏差，但是目前的初步結(jié)果提示，不同綿羊品種對該病感染的應答存在一定差異。本地羊適應新疆的自然環(huán)境和氣候，并始終堅持自繁自養(yǎng)，雖然MP抗體、抗原陽性檢出率高，但感染該病后死亡率不高。在實地調(diào)查過程中，我們也觀察到本地品種羊只中表現(xiàn)咳嗽等發(fā)病癥狀的情況低于引進綿羊品種。提示，新疆引入綿羊品種與本地品種均可感染該病，但是該病在不同品種綿羊發(fā)病率可能存在差異。相關(guān)研究有待進一步展開。

伊犁地區(qū)薩?？搜騇P-Ag陽性率20.61%，與哈薩克羊MP-Ag陽性率20.04%相似。在巴州地區(qū)，巴音布魯克羊MP-Ag陽性率17.91%高于杜泊羊MP-Ag陽性率11.08%與薩福克羊MP-Ag陽性率14.70%，但差異不顯著（P＞0.05）。這可能因為杜泊羊與薩?？搜蛟?～3月齡的羔羊感染了綿羊支原體肺炎，發(fā)病后致死率高于新疆本地綿羊，也有可能通過屠宰等方式淘汰患病羊，造成群體中感染該病的患病羊只數(shù)量減少，導致各試驗群體中MP-Ag檢出陽性率并未呈現(xiàn)沒有顯著性差異。本次試驗中，我們對引進到伊犁地區(qū)和巴州地區(qū)的薩福克羊MP抗原抗體檢出率進行比較，伊犁地區(qū)薩?？搜騇P-Ag陽性率20.61%高于巴州地區(qū)薩?？搜?4.70%，差異不顯著（P＞0.05），伊犁地區(qū)薩?？搜騇P-Ab陽性率8.30%低于巴州地區(qū)薩?？搜?3.23%，差異不顯著（P＞0.05）。說明，在新疆南北疆不同地區(qū)規(guī)?；驁龅酿B(yǎng)殖環(huán)境下，引進品種均可感染綿羊支原體。

通過對新疆地區(qū)不同綿羊品種綿羊支原體肺炎血清學調(diào)查，了解了伊犁地區(qū)與巴州地區(qū)綿羊支原體肺炎的感染情況，證實了其綿羊感染支原體肺炎十分普遍，初步掌握了南北疆該病在當?shù)仄贩N和引進品種綿羊感染情況。研究表明，定期對規(guī)模化養(yǎng)殖場羊群、山區(qū)牧民羊群以及鄉(xiāng)村農(nóng)戶羊群進行綿羊支原體肺炎的排查，為兩地區(qū)綿羊支原體肺炎的科學防控提供血清流行病學依據(jù)，減少新疆養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟損失。