司立寧，王 嶸，秦海蘭，崔 浩，甘羅曼，趙延禮*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810016)

低氧訓(xùn)練已被廣泛應(yīng)用于各類體育項(xiàng)目，被認(rèn)為是提高有氧耐力成績(jī)的良好輔助練習(xí)方法，目前就其機(jī)制研究主要集中在血液指標(biāo)及最大吸氧量、毛細(xì)血管數(shù)目等方面。本研究主要關(guān)注血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)在低氧訓(xùn)練中發(fā)揮的作用及其對(duì)骨骼肌纖維組成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器選擇

SPF級(jí)雄性過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生小鼠購(gòu)自賽業(yè)生物科技公司。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；Myoglobin和PGC-1α蛋白兔抗多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。小動(dòng)物跑臺(tái)購(gòu)自泰盟科技有限公司；7500型號(hào)Realtime-PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.2 動(dòng)物分組及訓(xùn)練

將SPF級(jí)雄性過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生小鼠飼養(yǎng)8 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠分為6組(每組15只)，即野生小鼠低氧靜息組(C)、野生小鼠低氧訓(xùn)練30d組(C+T30)、野生小鼠低氧訓(xùn)練60d組(C+T60)、過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠低氧靜息組(H)、過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠低氧訓(xùn)練30d組(H+T30)和過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠低氧訓(xùn)練60d組(H+T60)。

小鼠飼養(yǎng)和訓(xùn)練在青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心(海拔2261m，氧含量16.3%)進(jìn)行。C組和H組小鼠僅做適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，C+T30組、C+T60組、H+T30組和H+T60組小鼠除做適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練外，還需做低氧訓(xùn)練(20m/min，坡度5°，60min/d，5d/w，30d和60d)。各組小鼠均于末次訓(xùn)練結(jié)束3 d后予持續(xù)運(yùn)動(dòng)(20m/min，坡度5°)，直至小鼠伏地，毛刷、聲、光、電刺激尾部均無效或人為驅(qū)趕都無法使小鼠繼續(xù)運(yùn)動(dòng)視為力竭，記錄力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻采用直接頸椎脫臼法處死小鼠，快速分離雙側(cè)腓腸肌。

1.3 紅肌纖維、白肌纖維面積百分率計(jì)算

肌纖維切片行ATP酶染色，Ⅱ型肌纖維顯深棕色或黑色，Ⅰ型肌纖維顯淺棕色或不顯色。切片封固后，采用Simple PCI顯微圖像分析儀拍照，每張切片選取5個(gè)獨(dú)立區(qū)域，利用Image pro plus 5.1系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算紅肌纖維和白肌纖維的面積百分率。

1.4 real time PCR檢測(cè)

采用Trizol試劑提取各組小鼠腓腸肌組織總RNA。取總RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板，以realtime PCR法擴(kuò)增myoglobin，內(nèi)對(duì)照為GAPDH。

1.5 免疫印跡檢測(cè)

每20 mg組織加入250 μL 含PMSF的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿后離心(4℃，13500r/min，15min)，吸取上清液于管中，取少量蛋白樣品測(cè)定濃度，其余蛋白樣中加入上樣緩沖液，于沸水中煮10 min，行十二烷基磺酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后孵育第1、2抗體后行ECL顯色曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析，多重兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間(表1)

Table 1Exhaustive exercise time of mice in each

*：與C組比較P<0.05；▲：與H組比較P<0.01；#：與C+T30組比較P<0.05；⊕：與C+T60組比較P<0.01

與C組相比，C+T30、C+T60組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加(P<0.05)；與H組相比，H+T30、H+T60組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)，并且與低氧訓(xùn)練野生小鼠相比，過表達(dá)HO-1轉(zhuǎn)基因小鼠低氧訓(xùn)練30 d和60 d后的小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

2.2 各組小鼠腓腸肌纖維橫斷面積(表2)

分組n紅肌纖維白肌纖維C15 15.28±3.73 47.33±2.22H15 16.47±1.68 46.19±2.59C+T3011 16.69±1.78 46.37±2.14H+T3012 19.81±3.48▲# 45.25±2.72C+T6011 18.24±2.66? 44.91±3.63H+T609 27.42±2.74▲⊕ 41.38±3.68▲F- 25.36 5.64P- 0.00 0.00

*：與C組比較P<0.05；▲：與H組比較P<0.01；#：與C+T30組比較P<0.05；⊕：與C+T60組比較P<0.01

與C組相比，C+T30組小鼠紅肌纖維面積略有增多，C+T60組小鼠紅肌纖維面積顯著增多(P<0.05)；與H組相比，H+T30、H+T60組小鼠紅肌纖維面積增多(P<0.01)，H+T60組小鼠白肌纖維減少(P<0.01)，并且與低氧訓(xùn)練的野生小鼠相比，H+T30、H+T60組小鼠紅肌纖維面積增加更顯著(P<0.05)，H+T60組小鼠白肌纖維減少(P<0.01)；另外，與H+T30組相比，H+T60組小鼠紅肌纖維面積增加顯著(P<0.01)，H+T60組小鼠白肌纖維減少(P<0.01)。

2.3 各組小鼠腓腸肌中myoglobin的表達(dá)情況(表3和圖1)

分組nRelative Myoglobin mRNA levelRelative Myoglobin protein levelC15 1.00±0.12 1.00±0.25H15 1.27±0.08 1.16±0.17C+T3011 1.33±0.25? 1.48±0.18?H+T3012 2.64±0.18▲# 2.25±0.24▲#C+T6011 1.77±0.22? 1.18±0.23?H+T609 4.19±0.28▲⊕ 5.14±0.15▲⊕F- 425.04 1222.88P- 0.00 0.00

*：與C組比較P<0.05；▲：與H組比較P<0.01；#：與C+T30組比較P<0.05；⊕：與C+T60組比較P<0.01

圖1 各組小鼠腓腸肌中Myoglobin的表達(dá)圖

與C組相比，C+T30、C+T60組小鼠腓腸肌中myoglobin mRNA的表達(dá)增加；與H組相比，H+T30、H+T60組小鼠腓腸肌中myoglobin mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，并且與低氧訓(xùn)練野生小鼠相比，H+T30、H+T60組小鼠腓腸肌中myoglobin mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與C組相比，C+T30組小鼠腓腸肌中myoglobin蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)；與H組相比，H+T30、H+T60組小鼠腓腸肌中myoglobin蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，并且與低氧訓(xùn)練野生小鼠相比，H+T30、H+T60組小鼠腓腸肌中myoglobin蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

2.4 各組小鼠腓腸肌中PGC-1α的表達(dá)情況(圖2和表4)

圖2各組小鼠腓腸肌中PGC-1α的表達(dá)圖

Figure2The expression of PGC-1α in gastrocnemius muscle of mice in each group

Table 4The Relative protein expression of PGC-1α in gastrocnemius muscle in each

*：與C組比較P<0.05；▲：與H組比較P<0.01；#：與C+T30組比較P<0.05；⊕：與C+T60組比較P<0.01

與C組相比，C+T30、C+T60組小鼠腓腸肌中PGC-1α的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與H組相比，H+T30、H+T60組小鼠PGC-1α的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，并且與低氧訓(xùn)練野生小鼠相比，H+T30、H+T60組小鼠腓腸肌中PGC-1α的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練30 d或60 d可延長(zhǎng)野生小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，而且低氧訓(xùn)練60 d可引起骨骼肌紅肌纖維增多和myoglobin、PGC-1α的表達(dá)增加；過表達(dá)HO-1能夠進(jìn)一步延長(zhǎng)小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，并且低氧訓(xùn)練30 d和60 d都可引起骨骼肌紅肌纖維增多和myoglobin 、PGC-1α的表達(dá)增加。

低氧訓(xùn)練是在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練周期中持續(xù)或間斷采用低氧條件刺激，利用高原自然低氧環(huán)境或人工模擬低氧對(duì)人體所產(chǎn)生的特殊生物學(xué)效應(yīng)，有利于提高運(yùn)動(dòng)中的抗缺氧生理反應(yīng)及適應(yīng)能力，進(jìn)而達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)的目的[1]。30多年來的研究證實(shí)低氧訓(xùn)練可通過多種途徑達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)耐力的目的[2-4]。常鳳等研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)高表達(dá)HO-1能夠延長(zhǎng)小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的恢復(fù)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生小鼠經(jīng)30 d或60 d低氧訓(xùn)練后力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)耐力增加。本研究獲得的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，過表達(dá)HO-1的小鼠經(jīng)30 d或60 d低氧訓(xùn)練后運(yùn)動(dòng)耐力增加更加顯著，提示HO-1在低氧訓(xùn)練中具有延長(zhǎng)小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間、提高運(yùn)動(dòng)耐力的作用。

骨骼肌通?？煞譃榧t肌纖維(氧化型慢肌)和白肌纖維(糖酵解型快肌)。紅肌纖維富含線粒體，依賴氧化代謝產(chǎn)能，收縮速度慢，不易疲勞，富含myoglobin，呈暗紅色。白肌纖維線粒體數(shù)目較少，依賴糖酵解途徑供能，收縮速度快，易疲勞，呈淡紅色[6]。有關(guān)低氧訓(xùn)練對(duì)骨骼肌肌纖維的影響存在兩種不同的觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為低氧訓(xùn)練可以促進(jìn)骨骼肌紅肌纖維增加；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為低氧訓(xùn)練不影響骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)變。Bigard[6]發(fā)現(xiàn)Wistar 鼠在低壓氧艙(5500m)行低氧訓(xùn)練4 w后觀察到紅肌纖維增加[7]。Hoppeler 等發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)員低住高訓(xùn)(3850m)6 w后紅肌纖維富含的myoglobin 蛋白表達(dá)顯著升高[8]。相反，Perhonen對(duì)于Wistar鼠行低氧(2500m)訓(xùn)練后的肌纖維組成無明顯變化[9]。Wistar鼠行低氧(4000m)游泳訓(xùn)練14 w的研究顯示腓腸肌纖維分布不受低氧和訓(xùn)練的影響[10]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，野生小鼠在低氧訓(xùn)練60 d后腓腸肌中紅肌纖維增多，過表達(dá)HO-1小鼠在低氧訓(xùn)練30 d和60 d時(shí)都引起了紅肌纖維顯著增多，與此同時(shí)都伴有myoglobin的表達(dá)增加，提示HO-1在低氧訓(xùn)練中具有促進(jìn)骨骼肌紅肌纖維增多的作用。由此看出，不同形式的低氧訓(xùn)練、不同的海拔高度、不同的訓(xùn)練時(shí)間以及不同動(dòng)物遺傳背景都會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果的差異，因此對(duì)于低氧訓(xùn)練影響肌纖維組成的結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

PGC-1α是過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1，在調(diào)節(jié)肌纖維類型的轉(zhuǎn)化和線粒體生物合成中發(fā)揮重要作用。PGC-1α在骨骼肌中的不同表達(dá)水平對(duì)運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生很大影響。骨骼肌特異過表達(dá)PGC-1α促進(jìn)肌纖維從白肌纖維向紅肌纖維轉(zhuǎn)化[11]。相反，骨骼肌特異性敲除PGC-1α可引起紅肌纖維向白肌纖維轉(zhuǎn)化，并且相對(duì)于野生小鼠，骨骼肌特異性敲除PGC-1α的小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短，運(yùn)動(dòng)耐力下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生小鼠低氧訓(xùn)練30 d后骨骼肌中PGC-1α的表達(dá)顯著增加，并且過表達(dá)HO-1可進(jìn)一步促進(jìn)PGC-1α的表達(dá)增加。該結(jié)果提示HO-1在低氧訓(xùn)練中促進(jìn)紅肌纖維增加可能是通過調(diào)節(jié)PGC-1α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HO-1在低氧訓(xùn)練中可顯著提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力，其機(jī)制可能是HO-1通過增加PGC-1α的表達(dá)促進(jìn)骨骼肌紅肌纖維增加實(shí)現(xiàn)的。