FA160糞便分析儀檢測性能評價及潛血陽性質(zhì)控品的制備*

林馥嘉， 歐財文， 林海標， 胡珺， 龐鑫， 彭玉連， 潘婉儀

廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科(廣東廣州 510120)

“糞便常規(guī)+潛血”是常規(guī)檢驗項目之一[1]，目前國內(nèi)檢查糞便常規(guī)主要還是使用傳統(tǒng)人工檢測法[人工顯微鏡檢測法和人工潛血(occult blood，OB)檢測法]，對消化道疾病的診斷和鑒別有重要作用[2-4]。隨著自動化技術和圖像智能識別技術的突破，越來越多的全自動糞便分析儀應用于臨床工作中[5]。但不同的儀器，其檢測性能各有差異[6]，為了保證我院引進的四川沃文特FA160糞便分析儀檢測的準確性，本文從空白試驗、重復性試驗、攜帶污染試驗、潛血檢測性能驗證試驗、準確性試驗和臨床標本檢測性能試驗探討FA160的臨床應用價值。目前市面上少有合適的潛血陽性質(zhì)控品，本文通過制備陽性臨界值濃度血紅蛋白液作為潛血陽性質(zhì)控品，并評估其在不同儲存條件下的穩(wěn)定性，擬解決潛血陽性質(zhì)控品的困境?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本

1.1.1 空白試驗標本 采用FA160儀器配套稀釋液作為空白試驗的評價標本。

1.1.2 重復性試驗標本 人為在人工顯微鏡法確認紅細胞(red blood cell，RBC)、白細胞(white blood cell，WBC)、蟲卵和真菌孢子均為陰性以及人工OB法(滿分通過廣東省臨檢中心潛血室間質(zhì)評的寶創(chuàng)雙聯(lián)試紙檢測法)檢測OB陰性的糞便標本中添加RBC、WBC、真菌孢子，配制成一個WBC、RBC、真菌孢子和OB均為陽性的標本。

1.1.3 攜帶污染試驗標本 取含有不同濃度的WBC、RBC、真菌孢子成分的糞便標本混勻后加入5個標本采集管中，制成H1、H2、H3、H4、H5號陽性標本，取樣本稀釋液加入5個標本采集管中，制成L1、L2、L3、L4、L5號空白標本。

1.1.4 潛血檢測性能驗證和潛血陽性質(zhì)控制備的標本 選擇乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病抗體皆為陰性，且血紅蛋白濃度為100 g/L的EDTA-K2抗凝新鮮全血標本一份。

1.1.5 潛血準確性試驗標本 采用2018年4月份廣東省臨檢中心糞便潛血室間質(zhì)評標本。

1.1.6 臨床評價實驗標本 2018年1—3月每天隨機抽取25例左右的臨床糞便標本，3個月一共隨機抽取了2 300例糞便標本。

1.2 儀器和試劑 四川沃文特FA160糞便分析儀，海爾HYC-940醫(yī)用冷藏冰箱，滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司)，分析純甲苯(廣州化學試劑廠)，沃文特糞便分析儀配套檢測卡，寶創(chuàng)潛血雙聯(lián)試紙條(廣州市寶創(chuàng)生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 空白評價方法 以FA160的稀釋液為標本在FA160上連續(xù)檢測10次，分析10次細胞等有形成分(WBC、RBC、蟲卵、真菌孢子)和潛血結(jié)果的情況。判斷標準：以陰性(-)結(jié)果為判斷值，檢測結(jié)果與判斷值比較，檢測結(jié)果陰性為符合，結(jié)果陽性則為不符合，計算檢測結(jié)果的符合率，并根據(jù)EP12-A2文件[7]，以符合率≥95%作為空白試驗通過的判斷標準。

1.3.2 重復性評價方法 使用一個人為制作的WBC、RBC、真菌孢子和潛血均為陽性標本，并在FA160上連續(xù)檢測11次，分析2～11次WBC、RBC、真菌孢子和潛血結(jié)果的情況。判斷標準：陽性(+)結(jié)果不能為陰性，計算符合結(jié)果重復率，并根據(jù)EP12-A2文件[7]，以重復率≥95%作為重復性一致的判斷標準。

1.3.3 攜帶污染評價方法 將已制備號的H1～H5的5個陽性標本和L1～L5的5個空白樣本分別交叉放置在試管架上，在FA160上檢測。判斷標準：以空白標本L1～L5的所有細胞等有形成分和OB結(jié)果為陰性作為判斷合格的標準。

1.3.4 潛血檢測性能驗證方法

1.3.4.1 血紅蛋白液的制備 根據(jù)FA160檢測卡說明書提供的線性范圍(0.20～2 000 μg/mL)的要求，制備以下濃度梯度血紅蛋白液，用于OB檢測性能的驗證和OB陽性質(zhì)控品濃度的定值，配制方法見表1。

表1 血紅蛋白液的制備

1.3.4.2 潛血檢測性能驗證試驗 使用表1制備的不同濃度血紅蛋白液進行上機檢測，每個濃度檢測3次，分析各濃度的檢測結(jié)果。

1.3.5 潛血準確性試驗方法 使用FA160檢測廣東省臨檢中心在2018年4月下發(fā)的糞便潛血室間質(zhì)評標本，并以臨檢中心回報的結(jié)果為參照，檢測結(jié)果與回報結(jié)果比較，結(jié)果一致為通過，通過率>80%為準確性試驗合格。

1.3.6 潛血陽性質(zhì)控制備方法

1.3.6.1 潛血陽性質(zhì)控濃度值確定 根據(jù)FA160潛血檢測性能驗證試驗結(jié)果，濃度為1 μg/mL的血紅蛋白液的潛血結(jié)果剛好為陽性，故可將1 μg/mL的血紅蛋白液定為沃文特潛血陽性質(zhì)控品的濃度。

1.3.6.2 潛血陽性質(zhì)控品穩(wěn)定性評估試驗 制備16瓶500 mL血紅蛋白濃度為1 μg/mL的沃文特潛血陽性質(zhì)控品母液，編號為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3、D4。A1～A4為不添加防腐劑，常溫儲存；B1～B4為添加2.5 mL分析純甲苯[8-9]，常溫儲存；C1～C4為不添加防腐劑，4℃儲存；D1～D4為添加2.5 mL分析純甲苯[8-9]，4℃儲存。每天在A1～D4中各取3 mL在FA160進行潛血試驗檢測。

1.3.7 臨床標本評價方法 用于儀器性能評價的每份糞便標本同時用FA160和人工檢測法進行檢測。人工檢測法嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)[10]和寶創(chuàng)雙聯(lián)試紙條說明書的要求操作，F(xiàn)A160法嚴格按照儀器的SOP要求操作，每份標本均在1 h內(nèi)完成檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，F(xiàn)A160和人工法的檢測結(jié)果采用2檢驗(McNemar檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；一致性采用kappa檢驗，kappa系數(shù)<0為一致性極差，0.0～0.2為差，>0.2～0.4為微差，>0.4～0.6為中度，>0.6～0.8為好，>0.8～1.0為極好[11-12]。自制潛血陽性質(zhì)控品穩(wěn)定性評估試驗結(jié)果，首先對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，然后采用單因素方差分析檢驗4種儲存條件下自制質(zhì)控品平均穩(wěn)定時間是否有差異，再采用SNK-q檢驗進行兩兩比較檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 空白試驗結(jié)果 空白試驗結(jié)果中的WBC、RBC、真菌孢子、膿細胞、蟲卵和OB試驗的結(jié)果符合率均為100%，均符合符合率>95%的判斷標準，空白試驗合格。

2.2 重復性試驗結(jié)果 重復性試驗結(jié)果中的WBC、RBC、真菌孢子和隱血試驗的結(jié)果符合率均為100%，均符合符合率>95%的判斷標準，F(xiàn)A160檢測結(jié)果重復性一致。

2.3 攜帶污染試驗結(jié)果 攜帶污染試驗結(jié)果中L標本的WBC、RBC、真菌孢子、隱血試驗的結(jié)果均為陰性，攜帶污染試驗合格。

2.4 OB檢測性能驗證結(jié)果 FA160潛血檢測卡的檢測線性與試劑卡說明書聲明的0.20～2 000 μg/mL的范圍一致。見表2。

表2 FA160潛血檢測性能評價結(jié)果

2.5 潛血準確性試驗 FA160糞便分析儀檢測廣東省臨檢中心下發(fā)的5個潛血室間質(zhì)評標本結(jié)果均為通過，通過率為100%，符合通過率>80%的判斷標準，潛血準確性試驗合格。

2.6 臨床標本評價試驗結(jié)果 2 300份糞便標本經(jīng)FA160自動檢測與人工法檢測OB和各有形成分，以人工OB法和人工顯微鏡法為金標準，F(xiàn)A160檢測OB、RBC、WBC、寄生蟲蟲卵和真菌孢子的敏感度分別為96.00%、91.89%、94.53%、85.71%和90.41%；特異度分別為98.96%、95.71%、96.04%、99.78%和97.80%；準確率分別為98.61%、95.52%、95.96%、99.74%和97.57%；kappa值分別為0.935、0.642、0.702、0.665和0.690，兩種方法檢測OB結(jié)果的一致性極好，檢測WBC、RBC、真菌孢蟲和卵子結(jié)果的一致性好。兩種方法檢測結(jié)果陽性率經(jīng)2檢驗統(tǒng)計分析，P值分別為0.110、0.000、0.000、0.219和0.000，兩種方法檢測OB和蟲卵陽性結(jié)果的差異無統(tǒng)計學意義，檢測WBC、RBC和真菌孢子陽性結(jié)果的差異有明顯的統(tǒng)計學意義，F(xiàn)A160的檢測陽性率均明顯高于人工檢測法。見表3～8。

表3 FA160與人工法檢測糞便標本的OB結(jié)果 例

kappa=0.935，P=0.110

表4 FA160與人工法檢測糞便標本RBC的結(jié)果 例

kappa=0.642，P=0.000

表5 FA160與人工法檢測糞便標本W(wǎng)BC的結(jié)果 例

kappa=0.702，P=0.000

2.7 自制潛血陽性質(zhì)控品穩(wěn)定實驗結(jié)果 根據(jù)FA160潛血檢測性能驗證試驗結(jié)果，將1 μg/mL的血紅蛋白液定為沃文特潛血陽性質(zhì)控品。其在各保存條件的穩(wěn)定時間：常溫無防腐劑平均穩(wěn)定時間為54.75 d，

表6 FA160與人工法檢測糞便標本蟲卵的結(jié)果 例

kappa=0.665，P=0.219

表7 FA160與人工法檢測糞便標本真菌孢子的結(jié)果 例

kappa=0.690，P=0.000

常溫有防腐劑平均穩(wěn)定時間為56.75 d，4℃無防腐劑平均穩(wěn)定時間141.75 d，4℃有防腐劑平均穩(wěn)定時間為146.25 d。兩兩比較各組的穩(wěn)定時間，常溫無防腐劑與常溫有防腐劑比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.425)，常溫無防腐劑與4℃無防腐劑比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，常溫無防腐劑與4℃有防腐劑比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，常溫有防腐劑與4℃無防腐劑比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，常溫有防腐劑與4℃有防腐劑比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，4℃無防腐劑與4℃有防腐劑，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.088)。見表9。

表8 FA160檢測臨床糞便標本的性能評價 %

表9 自制沃文特潛血陽性質(zhì)控品在不同條件穩(wěn)定時間的試驗結(jié)果

3 討論

糞便檢查對于消化道疾病的診斷具有重要價值，是消化道惡性腫瘤早期診斷的一個篩查指標[13-15]。隨著糞便質(zhì)量控制的提高和糞便有形成分識別技術的發(fā)展，近年全自動糞便分析儀有了質(zhì)的突破，越來越多的糞便分析儀投入使用[16-17]。所以在全自動糞便分析儀使用時，有必要對其進行全面評價，保證糞便檢測結(jié)果的準確性和有效性[18-19]。

為了打破傳統(tǒng)人工法，我院引進了FA160全自動糞便檢測儀，該儀器采用先進的軌道方式進樣、自動采集標本顏色性狀圖像、稀釋、混勻、過濾、穿刺吸樣、分液、截圖、識別、數(shù)據(jù)傳輸及結(jié)果保存，實現(xiàn)全程自動化，避免人為操作造成的誤差和隨意性，并消除檢測過程安全隱患，保證工作環(huán)境干凈、舒適，生物安全高。但為保證糞便檢測結(jié)果的準確性，本研究對FA160進行的全面評價。

通過FA160的基本檢測性能評價試驗的結(jié)果可知，OB和細胞等有形成分的空白試驗結(jié)果符合率為100%，重復性試驗的結(jié)果重復率100%，攜帶污染試驗合格，準確性試驗的結(jié)果合格率100%，并驗證了潛血檢測線性范圍與試劑說明書上的線性范圍一致。通過以上試驗，F(xiàn)A160的基本檢測性能符合臨床檢測要求。

通過臨床標本的評價試驗結(jié)果可知，F(xiàn)A160自動法與人工法檢測OB的一致性極好(kappa=0.935)，兩種方法檢測OB的陽性結(jié)果無差異(P=0.110)，F(xiàn)A160的陽性檢出率(12.39%)比人工法(11.96%)略高。其中人工法陽性而FA160陰性的有11例，通過對標本的形狀和檢測過程分析，其原因為后帶現(xiàn)象造成的假陰性和OB測試線太弱導致儀器無法識別。人工法陰性而FA160陽性的有21例，這21例經(jīng)過人工OB法復核，陽性為16例，仍為陰性的有5例，分析其原因：(1)標本挑取量和部位不一樣，人工法僅挑取標本其中的小部分，而FA160則采用所有標本進行檢測， FA160的檢測靈敏度較高；(2)反應時間控制不一樣，人工法無法精準控制反應時間， FA160則可精準控制反應時間；(3)結(jié)果識別不一樣，人工法為人眼識別，個體差異較大，F(xiàn)A160為成像識別系統(tǒng)識別，差異小；(4)兩種方法的OB試劑的敏感度不一致。通過上述的結(jié)果和原因分析，F(xiàn)A160的OB檢測符合臨床檢測要求，能保證OB結(jié)果的準確性。

對于有形成分的檢測的結(jié)果分析，F(xiàn)A160和人工法檢測WBC、RBC、蟲卵和真菌孢子結(jié)果的一致性好，kappa值分別為0.642、0.702、0.665和0.690，兩種方法檢測蟲卵陽性結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P=0.219)，檢測WBC、RBC和真菌孢子的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，F(xiàn)A160的檢測陽性率均明顯高于人工檢測法。通過對兩種方法檢測有形成的結(jié)果分析，人工法RBC陽性而FA160陰性的有9例，人工法RBC陰性而FA160陽性的有94例，經(jīng)人工對9例陰性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)6例圖片有RBC，3例為無RBC，對94例陽性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)28例圖片有RBC，66例為無RBC；人工法WBC陽性而FA160陰性的有7例，人工法WBC陰性而FA160陽性的有86例，經(jīng)人工對7例陰性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)4例圖片有WBC，3例為無WBC，對86例陽性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)24例圖片有WBC，62例為無WBC；人工法蟲卵陽性而FA160陰性的有1例，人工法蟲卵陰性而FA160陽性的有5例，經(jīng)人工對1例陰性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)這1例圖片有肝吸蟲卵，但儀器沒能識別，對5例陽性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)2例圖片有肝吸蟲卵，3例為無蟲卵；人工法真菌孢子陽性而FA160陰性的有7例，人工法真菌孢子陰性而FA160陽性的有49例，經(jīng)人工對7例陰性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)6例圖片有真菌孢子，1例為無真菌孢子，對49例陽性的圖片進行識別，發(fā)現(xiàn)15例圖片有真菌孢子，34例為無真菌孢子。分析其原因為：(1)標本挑取量和部位不一樣，人工法僅挑取標本其中的小部分，而FA160則采用所有標本進行檢測， FA160的檢測敏感度較高；(2)觀察方法不同，人工法可人為的選取一些視野觀察，對可疑的視野可重復觀察，F(xiàn)A160儀器法只能固定位置抓取和識別；(3)部分標本糞渣成分大，遮擋了儀器對細胞等有形成分的識別；(4)部分標本背景雜質(zhì)多，干擾了儀器對細胞等有形成分的識別；(5)FA160對于一些大小、形態(tài)與細胞等有形成分相似的糞渣識別敏感度較低。

另外，F(xiàn)A160檢測WBC、RBC、蟲卵和真菌孢子的敏感度分別為91.89%、94.53%、85.71%和90.41%；特異度分別為95.71%、96.04%、99.78%和97.80%；準確率分別為95.52%、95.96%、99.74%和97.57%。綜上分析，F(xiàn)A160符合臨床檢測要求，能保證糞便檢測結(jié)果的準確性。但本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A160還是存在較高的假陰性率和假陽性率，易受識別背景的干擾和易把一些糞渣誤判成細胞等有形成分。因此，糞便有形成分檢驗的金標準仍然是人工鏡檢[13]，當利用儀器自動識別發(fā)現(xiàn)有形成分和標本顏色和(或)性狀異常而儀器檢測陰性時，需要對儀器拍攝的實景圖像進行人工審核確認后才可發(fā)出陽性報告[20-21]。國內(nèi)外大量報道已經(jīng)證明，自動化和智能化儀器無論如何先進都不能完全代替人工鏡檢，檢驗人員自身的形態(tài)學辨識能力應更加得到重視[22]。

室內(nèi)質(zhì)控是檢驗工作中的靈魂，開展室內(nèi)質(zhì)控是保證糞便潛血試驗質(zhì)量的必要措施[23]。但市面上少有合適潛血陽性質(zhì)控品，為了保證沃文特糞便分析儀潛血結(jié)果的準確性，本文制備濃度為1 μg/mL血紅蛋白液作為潛血陽性質(zhì)控品，并以4℃不添加防腐劑作為自制潛血陽性質(zhì)控品的保存條件。本文中的潛血陽性質(zhì)控品配制簡單，無需復溶，質(zhì)量穩(wěn)定，實用價廉，完全滿足FA160分析儀潛血試驗的室內(nèi)質(zhì)控要求，解決了目前潛血陽性質(zhì)控品的困境，保證糞便潛血檢測結(jié)果的準確性。

綜上所述，沃文特FA160糞便分析儀適用于臨床糞便標本的檢測。本文制備的濃度為1 μg/mL的血紅蛋白液作為潛血陽性質(zhì)控品適合臨床使用，日?？墒褂?℃無防腐劑作為自制潛血質(zhì)控液的保存條件。