雞馬立克氏病與白血病混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

俞遠(yuǎn)榮，汪德生

(1.貴州省榕江縣農(nóng)業(yè)局，貴州 榕江 557200；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

雞馬立克氏病(Marek’s disease，MD)是雞的一種淋巴組織增生性疾病，以外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚等單個(gè)或多個(gè)組織器官發(fā)生單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征。本病是由細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒引起的傳染性腫瘤病，病雞常見(jiàn)消瘦、肢體麻痹，并常有急性死亡[1]。雞白血病(Avian leukosis)是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起雞的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，臨床上有多種表現(xiàn)形式，主要是淋巴白血病，其次是成紅細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、骨髓細(xì)胞病、腎母細(xì)胞瘤、骨石病、血管瘤、肉瘤和皮瘤等[2]。2018年3月，某養(yǎng)雞場(chǎng)出現(xiàn)病雞縮頭閉眼、離群呆立、流淚、腹瀉、消瘦、雞冠小而蒼白為特征的病例，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為馬立克氏病與禽白血病混合感染。現(xiàn)將診斷情況報(bào)道如下。

1 發(fā)病情況

2018年1月10—17日，該雞殖場(chǎng)引進(jìn)30日齡小香雞脫溫苗8 600羽進(jìn)行放養(yǎng)，3月11日部分雞出現(xiàn)縮頭閉眼、離群呆立、流淚、腹瀉等癥狀，雞體消瘦，雞冠小而蒼白，隨后出現(xiàn)死亡，用抗生素治療無(wú)效。至5月14日全群發(fā)病，發(fā)病率高達(dá) 100%，已死亡4 600只，死亡率為53.49%(4 600/8 600)。

2 病理變化

解剖病死雞發(fā)現(xiàn):部分肝臟腫大，有白色壞死點(diǎn)；心包腔積液，表面有壞死結(jié)節(jié)；脾臟腫大；腺胃腫大，乳頭與乳頭之間發(fā)生融合；十二指腸腸壁增厚，有出血；扁桃體腫大、出血；腎臟腫大。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢取病死雞肝臟直接觸片，染色鏡檢，未觀察到細(xì)菌。同時(shí)將病料接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h觀察，未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。

3.2 馬立克氏病抗原檢測(cè)采集病死雞羽髓經(jīng)常規(guī)處理，與標(biāo)準(zhǔn)馬立克氏病陽(yáng)性血清(抗體)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，結(jié)果檢測(cè)抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清產(chǎn)生白色沉淀線，表明在羽髓中存在馬立克氏病病毒(抗原)。見(jiàn)圖1。

圖1 馬立克氏病羽髓病毒抗原檢測(cè)

3.3 馬立克氏病抗體檢測(cè)采集送檢病雞血液，以3 500 r/min離心10 min，分離血清，與標(biāo)準(zhǔn)馬立克氏病陽(yáng)性抗原進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，結(jié)果檢測(cè)血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原產(chǎn)生白色沉淀線，表明在血液中存在馬立克氏病抗體。見(jiàn)圖2。

圖2 馬立克氏病血清抗體檢測(cè)

3.4 相關(guān)病毒核酸檢測(cè)

3.4.1新城疫病毒核酸檢測(cè):取送檢病死雞的肝臟和脾臟，分別加入適量DEPC溶液充分研磨后，提取其RNA。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，未檢出新城疫病毒核酸。

3.4.2禽白血病病毒核酸檢測(cè):核酸提取方法同新城疫。(1)反轉(zhuǎn)錄:用康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒。反應(yīng)體系(總體積20 μL):Dntp Mix 2.5 mmol/L Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 2 μL，Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFiScript 1 μL，Water 5 μL。 充分混勻后，42 ℃ 孵育30～50 min，85℃孵育5 min。 1 000 r/min離心30 s，-20℃冷卻。(2)PCR擴(kuò)增:取反轉(zhuǎn)錄所得樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物(P1)和下游引物(P2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，2×EsTaqMasterMix購(gòu)自康為世紀(jì)公司。反應(yīng)體系(總體積25 μL):EsTaqMix 12.5 μL，模板 DNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，ddH2O 8.5 μL。 陰性對(duì)照用無(wú)酶水代替模板cDNA。(3)做好標(biāo)記后在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序:95℃ 4 min；94℃30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共循環(huán) 33 次；再72℃延伸10 min。(4)電泳:在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入溶解的瓊脂凝膠。待凝固后取出梳子，在瓊脂糖凝膠孔中加入2 000 bp DNA Marker(購(gòu)自TaKa-Ra公司)5 μL和 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL。以100 V電壓電泳，30 min后用凝膠成像儀觀察結(jié)果。由圖3可見(jiàn)，檢測(cè)樣品在921 bp處出現(xiàn)特異性條帶，判定禽白血病病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

圖3 禽白血病病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.4.3馬立克氏病病毒核酸檢測(cè):核酸提取方法同新城疫。(1)取反轉(zhuǎn)錄所得樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增:上游引物(MD1)和下游引物(MD2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，2×EsTaqMasterMix購(gòu)自康為世紀(jì)公司。(2)反應(yīng)體系(總體積25 μL):EsTaqMix 12.5 μL，模板 DNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL。 陰性對(duì)照用無(wú)酶水代替模板DNA。(3)做好標(biāo)記后在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序:95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共循環(huán)33次；再72℃延伸10 min。(4)電泳:在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入溶解的瓊脂凝膠。待凝固后取出梳子，在瓊脂糖凝膠孔中加入2 000 bp DNA Marker(購(gòu)自TaKaRa公司)5 μL和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，以100 V電壓電泳，30 min后用凝膠成像儀觀察結(jié)果。結(jié)果判定:陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品出現(xiàn)809 bp擴(kuò)增帶為禽白血病病毒陽(yáng)性，否則為陰性。由圖4可見(jiàn)，檢測(cè)樣品在809 bp處出現(xiàn)特異性條帶，判定馬立克氏病病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

圖4 馬立克氏病病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 結(jié)果與討論

4.1根據(jù)流行病學(xué)、病理變化、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，確診送檢病雞為馬立克氏病和禽白血病混合感染。

4.2馬立克氏病、禽白血病都屬于免疫抑制疾病，主要侵害免疫器官，如肝臟、脾臟、法氏囊等，目前對(duì)該類疫病無(wú)特效藥物進(jìn)行治療，一旦感染其中的任何1種疫病，只能淘汰處理。

4.3針對(duì)以上2種疫病的預(yù)防主要采取以下方法:(1)種禽場(chǎng)在雛雞出殼的24 h內(nèi)接種馬立克氏病疫苗，且在接種后的7日齡內(nèi)嚴(yán)格環(huán)境消毒，防止雞體未產(chǎn)生抗體就感染野毒。(2)禽白血病目前尚無(wú)疫苗進(jìn)行預(yù)防，種禽場(chǎng)主要采取凈化方法。