慢性鎘暴露對背角無齒蚌肝臟的氧化損傷效應(yīng)

賈嘉寶，井維鑫，李涌泉，王蘭，劉娜

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

鎘（cadmium，Cd）是一種工業(yè)上廣泛應(yīng)用、具有極強(qiáng)毒性的蓄積性環(huán)境污染物，被認(rèn)為是水生態(tài)系統(tǒng)中對生物毒性最強(qiáng)的一種重金屬[1]，可通過冶煉、合金制造、電鍍、印染等生產(chǎn)活動(dòng)排放到環(huán)境中，通過食物鏈傳遞進(jìn)入人體。近年來，我國水體鎘污染事件頻發(fā)，對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅，引起社會(huì)各界對鎘毒性的廣泛關(guān)注。

鎘可通過多種途徑進(jìn)入生物體細(xì)胞，直接或間接參加生物體內(nèi)的生化反應(yīng)，產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的生物損傷[2]。已有研究顯示，鎘可在魚類、蝦、蟹等水生動(dòng)物體內(nèi)富集[3-4]，引起肝臟[5]、免疫系統(tǒng)[6]、生殖系統(tǒng)[7]等損傷。劉建博等[8]發(fā)現(xiàn)不同濃度鎘暴露5 d 可引起文蛤（Meretrix meretrix）肝胰腺超微結(jié)構(gòu)損傷；李艷東等[9]研究表明，中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）暴露于 Cd2+96 h 后其肝胰腺中胃蛋白酶、類胰蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性均受到不同程度的抑制。但這些研究大多采用急性暴露方式，暴露時(shí)間較短，不能全面反映鎘的毒性效應(yīng)及作用機(jī)制。在實(shí)際環(huán)境中，水生動(dòng)物通常長期暴露于污染水體，所以研究鎘對水生動(dòng)物的慢性毒性效應(yīng)具有更重要的現(xiàn)實(shí)意義。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）俗稱河蚌，是我國常見的淡水經(jīng)濟(jì)貝類，分布廣泛，埋棲生活在淡水湖泊、河流等底泥中，具有很強(qiáng)的污染物生物富集能力，對水環(huán)境中發(fā)生的物理、化學(xué)和生物性的各種變化反應(yīng)非常敏感，是較理想的水污染指示生物[10]。我們通過在實(shí)驗(yàn)室條件下，分析不同濃度Cd2+暴露4 周以及暴露結(jié)束后繼續(xù)用清水飼養(yǎng)4 周期間，背角無齒蚌肝臟中抗氧化酶活力及脂質(zhì)過氧化水平，探究慢性鎘暴露對背角無齒蚌的氧化損傷效應(yīng)及作用機(jī)制，為水環(huán)境鎘污染的生物監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

背角無齒蚌（殼長8.5±1.5 cm，寬4.8±1.3 cm，高3.2±1.2 cm）購自太原市五龍口水產(chǎn)市場，在實(shí)驗(yàn)室條件下（室溫16～20℃，相對濕度50%～60%）馴養(yǎng)3 周，每48 h 換水1 次，養(yǎng)殖用水為曝氣48 h的自來水，每次換水后投喂商品飼料。

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鎘標(biāo)準(zhǔn)液（色譜純）購自北京百靈威科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）活力檢測試劑盒，丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒和蛋白質(zhì)濃度（Bradford 法）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 Cd2+暴露

根據(jù)背角無齒蚌96 h 鎘半數(shù)致死劑量（134.9 mg/L）[11]設(shè)置 1 個(gè)對照組和 2 個(gè)處理組（Cd2+濃度為 0.1 和 0.5 mg/L），每組設(shè)置 3 個(gè)平行。隨機(jī)選取144 只身體健康、大小相近的背角無齒蚌置于 9 個(gè)水族箱（50 cm×40 cm×30 cm）中，每箱16 只，暴露水體為5 L，對照組為曝氣的自來水，處理組為不同濃度的Cd2+溶液。實(shí)驗(yàn)包括2 個(gè)階段，共持續(xù)8 周：第一階段為鎘暴露期，用不同濃度Cd2+暴露背角無齒蚌4 周，每48 h 換水1 次；第二階段為鎘清除期，即將Cd2+暴露4 周后的背角無齒蚌再用清水飼養(yǎng)4 周，每48 h 換水1 次。實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)期間完全一致。

1.3 水體中Cd2+濃度測定

鎘暴露期間對水體中Cd2+濃度進(jìn)行測定，水樣采集時(shí)間為每次換水后（0 h）、24 h 和48 h，采樣點(diǎn)如圖1所示，取5 個(gè)采樣點(diǎn)的平均值作為當(dāng)天的水體Cd2+濃度值，暴露期間共收集3 次水樣。參考楊曉婧等[12]方法，采用火焰原子吸收光譜法測定水體中Cd2+濃度。

1.4 組織樣品制備與生化指標(biāo)分析

分別在鎘暴露期和鎘清除期的不同時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)水族箱隨機(jī)取2 只背角無齒蚌，剖取肝臟組織，吸干表面水分，稱重，用液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)按1∶4的質(zhì)量體積比在組織中加入預(yù)冷的生理鹽水（0.86%），制成20%的組織勻漿液，4000 r/min 離心10 min，取上清液用于生化指標(biāo)分析。用檢測試劑盒測定SOD、CAT 和GPx 活力，MDA 含量和蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果以與對照組數(shù)值的百分比表示。

圖1 水樣采集示意圖

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 暴露水體中Cd2+含量

如表1和圖2所示，換水后 0 h 水體中 Cd2+含量與設(shè)置的濃度值相近，換水后24 h 時(shí)各處理組水體中Cd2+含量有所下降，0.5 mg/L 組Cd2+濃度極顯著低于 0 h 值，48 h 時(shí) 0.1 和 0.5 mg/L 組 Cd2+濃度均極顯著低于0 h 值。

2.2 鎘暴露對SOD活力的影響

由圖3可知，0.1 mg/L Cd2+暴露并未對背角無齒蚌肝臟SOD 活力產(chǎn)生顯著影響，但0.5 mg/L組SOD 活力隨著暴露時(shí)間的延長而逐漸降低，即使在清除階段仍極顯著低于對照組水平（P＜0.01）。

2.3 鎘暴露對GPx活力的影響

低濃度Cd2+暴露3 周時(shí)誘導(dǎo)了背角無齒蚌肝臟GPx 活力顯著升高（P＜0.01），而在其他時(shí)間點(diǎn)無明顯影響（圖4），0.5 mg/L 組GPx 活力隨著暴露時(shí)間的延長而呈先升高后降低的變化趨勢，但均顯著高于對照組（除第1 周外），清除第2 周時(shí)GPx活力恢復(fù)至對照組水平。

表1 暴露階段飼養(yǎng)水體中的Cd2+含量（mg/L）

圖2 暴露階段飼養(yǎng)水體中Cd2+含量變化（n=3）

2.4 鎘暴露對CAT活力的影響

如圖5所示，除暴露第1 周CAT 活力顯著下降外（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)低濃度 Cd2+組CAT 活力較對照組無明顯變化。0.5 mg/L 組在暴露初期CAT 活力無顯著變化，第4 周時(shí)CAT 活力被極顯著抑制（P＜0.01），而且在清除階段仍極顯著低于對照組水平（P＜0.01）。

圖3 鎘對背角無齒蚌肝臟SOD活力的影響（n=6）

圖4 鎘對背角無齒蚌肝臟GPx活力的影響（n=6）

圖5 鎘對背角無齒蚌肝臟CAT活力的影響（n=6）

2.5 鎘暴露對MDA含量的影響

低濃度和高濃度Cd2+暴露均可誘導(dǎo)背角無齒蚌肝臟MDA 含量顯著升高（P＜0.05），并隨著暴露時(shí)間的延長MDA 含量呈時(shí)間依賴性上升趨勢（圖6）。清除階段各濃度組MDA 含量仍極顯著高于對照組水平（P＜0.01）。

圖6 鎘對背角無齒蚌肝臟MDA含量的影響（n=6）

3 討論

鎘能通過Ca2+通道透過細(xì)胞膜而進(jìn)入機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和自由基。這些活性物質(zhì)與體內(nèi)的生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)羰基化、脂質(zhì)過氧化、DNA斷裂等損傷，對生物體造成氧化脅迫甚至導(dǎo)致機(jī)體功能障礙[13]。正常情況下，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)可以維持體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)外界脅迫等因素引起ROS 過量而無法被清除時(shí)，就會(huì)造成機(jī)體的氧化損傷。SOD、GPx 和CAT 是抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，在機(jī)體防御氧化損傷中發(fā)揮重要作用。SOD 作為抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，可將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和其他氫過氧化物[14]。在真核生物的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中存在 2 種 SOD，即 Cu/Zn-SOD 和 Mn-SOD，Cd 作為Zn的同族元素，其離子結(jié)構(gòu)與Zn2+和Mn2+相似，所以 SOD 中的 Zn2+或 Mn2+能夠被 Cd2+置換[15]，而被置換了金屬離子的SOD 分子構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其活力下降甚至喪失。本研究顯示，0.5 mg/L Cd2+可以顯著抑制背角無齒蚌肝臟SOD 活力，而且隨著暴露時(shí)間的延長機(jī)體蓄積了大量Cd2+，它們置換了SOD的金屬離子從而影響其分子構(gòu)象，導(dǎo)致SOD 活力下降甚至喪失。鎘清除階段，雖然沒有更多的Cd2+進(jìn)入體內(nèi)，但暴露期間進(jìn)入機(jī)體的Cd2+已造成SOD 分子改變和功能損傷，所以即使清水處理也不能使SOD 活力恢復(fù)至正常水平。

由SOD 歧化生成的H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，可以引起DNA 損傷和基因突變，還與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[16]。抗氧化酶CAT 可以催化H2O2分解為H2O 和O2從而起到解毒作用[17]。邢慧芳等[18]報(bào)道，不同濃度Cd2+暴露96 h 時(shí)，背角無齒蚌外套膜過氧化氫酶活力隨Cd2+濃度升高而呈現(xiàn)“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的規(guī)律性變化，鰓中CAT 活力則呈逐漸升高的趨勢，表明相同暴露條件下背角無齒蚌CAT 活力存在組織差異性。蔡垚[19]的研究顯示，低濃度Cd2+暴露3 d 可顯著誘導(dǎo)背角無齒蚌肝臟CAT 活力，而高濃度Cd2+暴露則明顯抑制CAT 活力。上述研究均為急性暴露，CAT 活力的波動(dòng)可能是背角無齒蚌對Cd2+脅迫的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，0.1 mg/L Cd2+暴露第1 周即明顯抑制了背角無齒蚌肝臟CAT 活力，與前期研究結(jié)果一致[18-19]，表明機(jī)體對Cd2+脅迫做出了應(yīng)激反應(yīng)，但隨著暴露時(shí)間的延長CAT 活力恢復(fù)至正常水平。0.5 mg/L Cd2+暴露第4 周時(shí)顯著抑制CAT 活力，直至清除結(jié)束CAT 活力仍處于較低水平。由此推測，低濃度Cd2+暴露可能在短期內(nèi)會(huì)引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為酶活力的變化，而隨著暴露時(shí)間的延長，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的其他因子如GPx 也可能被調(diào)動(dòng)發(fā)揮功能從而緩解了Cd2+對CAT 活力的影響。但當(dāng)高濃度Cd2+長期暴露時(shí)，大量的Cd2+可能對CAT的合成及分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的影響，所以導(dǎo)致CAT 活力被顯著抑制。

GPx 是一種含硒的抗氧化酶，也具有清除H2O2和氫過氧化物的功能[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1 mg/L Cd2+暴露并未對GPx 活力產(chǎn)生顯著影響，但當(dāng)0.5 mg/L Cd2+暴露2 周時(shí)背角無齒蚌肝臟GPx 活力被顯著誘導(dǎo)，且隨著暴露時(shí)間的延長GPx 活力一直處于較高水平。由此推測，在Cd2+暴露后期CAT 活力被顯著抑制時(shí)，機(jī)體可能主要通過GPx 清除H2O2。但是，長期暴露導(dǎo)致背角無齒蚌體內(nèi)蓄積了大量的Cd2+，機(jī)體產(chǎn)生的ROS 急劇增加，SOD 活力被抑制，抗氧化系統(tǒng)的防御功能受損，同時(shí)過量的Cd2+還可能不同程度地影響了抗氧化酶的合成及分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶含量和活力均下降，所以造成機(jī)體的氧化損傷，例如本研究中脂質(zhì)過氧化物MDA 含量隨著暴露時(shí)間的延長急劇升高。這與鄧思平等[21]的研究結(jié)果一致。脂質(zhì)過氧化為多不飽和脂肪酸或脂質(zhì)在活性氧攻擊下的氧化變質(zhì)，將直接干擾和破壞膜的生物功能，最終影響機(jī)體的生理機(jī)能[22]。

綜上所述，慢性Cd2+暴露可以通過抑制SOD活力、激活GPx 活力而影響抗氧化防御系統(tǒng)功能，長期、過量的Cd2+蓄積破壞了機(jī)體正常的氧化還原平衡，引起氧化損傷。然而，鎘的慢性毒性作用機(jī)制與急性毒性有所不同。鑒于實(shí)際環(huán)境中水生動(dòng)物大多是長期暴露于低劑量的污染物中，所以對于環(huán)境暴露劑量下污染物的慢性毒性研究應(yīng)予以更多的重視。