閩西寧化2 個鐵皮石斛品系離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

潘 紅，張 靜，賴呈純，黃賢貴，王 琦，高慧穎，

賴鐘雄1*

（1.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術研究所，福建福州350003）

鐵皮石斛（Dendrobium candidumWall.ex Lindl.）屬于蘭科石斛屬多年生草本附生植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，富含生物堿、多糖、類黃酮等活性物質[1]。鐵皮石斛生長緩慢、自身繁殖能力低，但市場需求大，價格高。野生鐵皮石斛因被過度采挖，環(huán)境破壞，已瀕臨滅絕[2]。目前，鐵皮石斛是國家重點保護藥用植物、中國珍稀瀕危二級保護植物，已被列入中國植物保護紅皮書[3]。鐵皮石斛的自然分布區(qū)域非常廣，生長環(huán)境差異較大，由此出現(xiàn)明顯的種類變異，不同產(chǎn)地鐵皮石斛莖表面的紫色斑點分布情況不同，有些紫色斑點少，密度較小，顏色淺，即稱“青桿鐵皮”；而有些產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛莖紫色斑點較多，密度大，顏色呈紫紅色，即稱“紅桿鐵皮”[4]。紅桿鐵皮石斛的藥用價值高于青桿鐵皮石斛[5]，更受到消費者的青睞。不同品種的植物生長狀態(tài)存在差異性，目前關于二者在組織培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出的具體差異報道較少。該試驗通過8 種培養(yǎng)基對閩西寧化2 個鐵皮石斛品系的離體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期篩選出適合2 個品系鐵皮石斛叢生芽增殖、根系生長等的培養(yǎng)基，并比較二者之間的離體培養(yǎng)下的生長差異，從而為閩西寧化紅桿鐵皮石斛和青桿鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn)及次生代謝產(chǎn)物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

閩西寧化紅桿與青桿2 個鐵皮石斛品系來源于福建省清流縣邱元農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司蘭花資源圃，由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術研究所食品資源研究室通過莖段直接誘導不定芽獲得的試管苗。

1.2 方法

1.2.1 離體培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。根據(jù)前期試驗的結果，設計了8 組培養(yǎng)基對2 個鐵皮石斛品系叢生芽增殖進行優(yōu)化，培養(yǎng)基配方如下：

T1：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T2：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T3：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp（氨芐青霉素）1 mg/L；T4：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp 1 mg/L；T5：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T6：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T7：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L；T8：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L。

含有Amp 的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40℃左右添加，搖勻分裝。香蕉泥用新鮮果實打漿而成，土豆泥用新鮮塊莖去皮打漿而成。所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH 5.8。于高壓滅菌鍋中121℃、0.11MPa 下高溫滅菌20 min。

1.2.2 接種與培養(yǎng)。切取生長狀態(tài)一致且?guī)? 個腋芽的去葉莖段，橫放接種到叢生芽增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種3 個莖段，接種5 瓶，重復3 次。培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光照強度4 000～5 000 lx，光照時間12 h/d。培養(yǎng)至60 d 統(tǒng)計紅桿和青桿鐵皮石斛叢生芽的株高、芽數(shù)和增殖系數(shù)，觀察生長狀況。

增殖系數(shù)=增殖所得叢生芽的總芽數(shù)/接種的總莖段數(shù)

1.2.3 生根壯苗培養(yǎng)。選擇生長健壯的試管苗，切取具有4～5 片真葉、3 cm 左右高度的芽苗接種于生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+1 g活性炭+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH 5.8。每瓶接種5個芽苗，接種5 瓶，重復3 次。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)至60 d，統(tǒng)計1 級根數(shù)量、2 級根數(shù)量、根系長度、叢生芽數(shù)量。對比2 個品種之間生根壯苗的差異。

1.2.4 煉苗移栽。生根壯苗培養(yǎng)試管苗生長至60 d時，進行煉苗移栽。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。運用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，利用DPS 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛生長的影響

2.1.1 生長狀態(tài)。不同處理的培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽生長狀態(tài)具有較大的影響。從形態(tài)上觀察，T1 培養(yǎng)基叢生芽莖段相比于T2 培養(yǎng)基較為粗壯，葉片大而濃綠（圖1A 和圖1B）。添加Amp 增殖的叢生芽，短縮細弱，叢生芽誘導不整齊一致，有的莖段只長幾個較大叢生芽，有的則緊縮成團（圖1C 和圖1D）。T5、T6 和T7、T8 培養(yǎng)基則中部分莖段黃化死亡，內(nèi)生菌大量出現(xiàn)。在培養(yǎng)過程中，T5、T6 培養(yǎng)基內(nèi)生菌增殖最為明顯，其次是T7、T8 培養(yǎng)基。T5、T6培養(yǎng)基中的紅桿鐵皮石斛葉片變短并出現(xiàn)明顯紅色（圖1E 和圖1F），T8 也出現(xiàn)葉片短小葉色變紅的現(xiàn)象（圖1H）。

2.1.2 叢生芽增殖。紅桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)見圖2。只添加KT 和6-BA 的培養(yǎng)基T1 與T2 之間具有極顯著性差異，6-BA 有利于叢生芽的增殖。添加Amp 后，T1 培養(yǎng)基的增殖能力極顯著提高，此時T3 與T4 培養(yǎng)基之間對叢生芽增殖影響差異不大，T4 的增殖系數(shù)達到11.72，為所有優(yōu)化培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最高。T5、T6 和T7、T8 培養(yǎng)基的叢生芽增殖系數(shù)極顯著下降，之間增殖系數(shù)不存在差異性，其中T8 培養(yǎng)基增殖系數(shù)低至1.35。

圖1 紅桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖系數(shù)的影響

2.1.3 叢生芽株高。結合圖2、圖3 可以看出，叢生芽增殖與株高成反比。增殖系數(shù)越大，株高值越小。添加KT 的培養(yǎng)基和添加6-BA 的培養(yǎng)基在株高上具有差異性。T1 與T2 培養(yǎng)基之間株高具有極顯著性差異，KT 有促進紅桿鐵皮石斛伸長生長的作用。對比幾個添加KT 的處理，以含有KT 為基礎的培養(yǎng)基上添加Amp、土豆泥、香蕉泥并不能使紅桿鐵皮石斛株高更高。T8 培養(yǎng)基含有6-BA，其誘導的叢生芽株高與T7 對比，存在顯著性差異，香蕉泥的添加，增殖系數(shù)少，植株營養(yǎng)競爭小，都可能促進T8 培養(yǎng)基中紅桿鐵皮石斛伸長生長。

圖3 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽株高的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對青桿鐵皮石斛生長的影響

2.2.1 生長狀態(tài)。不同培養(yǎng)基誘導的青桿鐵皮石斛叢生芽生長狀態(tài)存在較大差異，從形態(tài)上看，添加KT 的培養(yǎng)基，除T5 外，T1、T3、T7 培養(yǎng)基都能促使青桿鐵皮石斛伸長生長，葉色濃綠，根系生長較多（圖4M、4I、4K 和圖4O）。添加6-BA 的培養(yǎng)基，除T6外，T2、T4、T8 培養(yǎng)基都能促使青桿鐵皮石斛莖段短縮，萌發(fā)較多的叢生芽，根系較少。添加土豆泥的T5、T6 培養(yǎng)基會使內(nèi)生菌大量生長，青桿鐵皮石斛幾乎不增殖。香蕉泥的使用，青桿鐵皮石斛部分莖段死亡，叢生芽誘導少，植株葉片易變紅，但根系生長卻最為粗壯，根系上的白色絨毛多（圖4O 和圖4P）。

圖4 青桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基上的生長情況

2.2.2 叢生芽增殖。從圖5 中的增殖系數(shù)中可看出，T1 與T2 培養(yǎng)基之間存在極顯著性差異，6-BA 對青桿鐵皮石斛叢生芽分化具有促進作用。T4 培養(yǎng)基最有利于叢生芽增殖，增殖系數(shù)達到32.56，與其他處理組之間存在極顯著性差異。T3 培養(yǎng)與未添加Amp的T1 處理相比，出現(xiàn)了抑制，抑制結果為極顯著性差異。與紅桿鐵皮石斛一樣，T5、T6 培養(yǎng)基和T7、T8培養(yǎng)基對叢生芽的增殖具有極顯著的抑制作用，T5培養(yǎng)基增殖系數(shù)最低為0.26。

2.2.3 株高。結合圖5、圖6 可看出，青桿鐵皮石斛叢生芽增殖系數(shù)與株高成反比。增殖系數(shù)越大，株高值越小。從數(shù)據(jù)上可以看出，KT 有促進植株增高的作用。其中添加香蕉泥的T7 培養(yǎng)基對青桿鐵皮石斛的株高產(chǎn)生了極顯著的促進作用，平均株高達到2.92 cm。T8 培養(yǎng)基含有6-BA，其株高與只添加KT 的T1 培養(yǎng)基無差異，香蕉泥能夠促進青桿鐵皮石斛的生長。

2.3 2 個品系鐵皮石斛生根壯苗的差異

結合叢生芽增殖的結果，接種的單株來源于T1培養(yǎng)基生長較高且健壯的莖段，設計了添加香蕉泥的生根培養(yǎng)基用于2 種鐵皮石斛的生根壯苗培養(yǎng)。從表1 可以看出，紅桿與青桿鐵皮石斛2 個品系間，1 級根系數(shù)存在顯著性差異，紅桿鐵皮石斛生根能力略強于青桿鐵皮石斛；2 級生根系數(shù)不存在差異；根系長度存在顯著性差異，青桿鐵皮石斛的平均根系長度較紅桿鐵皮石斛長；平均分蘗數(shù)存在顯著性差異，紅桿鐵皮石斛分蘗能力較青桿鐵皮石斛弱。從圖7 可看出，2 個品種之間生長狀態(tài)差異不明顯，均根系發(fā)達健壯，葉色濃綠，莖段較粗，生長旺盛。

2.4 煉苗移栽

圖7 2 個品系鐵皮石斛生根壯苗

表1 2 個品系鐵皮石斛生根差異性

將在生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d 的鐵皮石斛出瓶苗移至常溫下閉蓋煉苗3 d，再進行松蓋煉苗3 d。輕取試管苗，在清水中輕柔洗凈根部培養(yǎng)基。陰干后種植于松樹皮基質中。定植后澆水，遮陰，每天早晚噴水，保持空氣濕度在80%左右。2 周后可見莖尖伸長，移栽成活率可在80%以上。

3 結論與討論

（1）綜合試驗數(shù)據(jù)，能夠分析出2 個品系鐵皮石斛叢生芽生長情況的差異性。青桿鐵皮石斛和紅桿鐵皮石斛在8 種優(yōu)化培養(yǎng)基所表現(xiàn)出的叢生芽增殖趨勢大致相似。6-BA 的添加對紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛的叢生芽增殖都有著極顯著的促進作用。KT 對叢生芽增殖誘導效果沒有6-BA 強，但紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛植株都表現(xiàn)出生長健壯、葉色濃綠等優(yōu)勢。在純添加激素的培養(yǎng)中，紅桿鐵皮石斛叢生芽的增殖能力小于青桿鐵皮石斛，青桿鐵皮石斛在T1 培養(yǎng)基中增殖系數(shù)是紅桿鐵皮石斛的2.11倍，青桿鐵皮石斛在T2 培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)是紅桿鐵皮石斛的1.89 倍。2 個品種共同表現(xiàn)出叢生芽增殖系數(shù)越高，相對應的株高越矮的趨勢。紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛在T1 培養(yǎng)基、T2 培養(yǎng)基中的株高無明顯差異。

（2）植物生長調節(jié)劑在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中起到關鍵作用，紅桿鐵皮石斛在T2 培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)是T1 培養(yǎng)基的1.68 倍。青桿鐵皮石斛在T2培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)是T1 培養(yǎng)基的1.50 倍。6-BA 是最有利于叢生芽增殖的細胞分裂素，這與李玉萍等[6]、鄧成華等[7]、琚淑明等[8]報道相一致。促進伸長生長最佳細胞分裂素是KT，T1 培養(yǎng)基中生長的紅桿鐵皮石斛株高是T2 培養(yǎng)基的1.81 倍。T1 培養(yǎng)基培養(yǎng)的青桿鐵皮石斛株高是T2 培養(yǎng)基的1.50 倍。綜合試驗結果認為，誘導紅桿鐵皮石斛和青桿鐵皮石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，叢生芽增殖多，且較為一致。壯苗最佳培養(yǎng)基為MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，植株莖段較粗，葉色濃綠，生長較快。在無內(nèi)生菌的情況下，可添加香蕉泥。

（3）植物內(nèi)生菌在一定階段或全階段生存于植物體內(nèi)，與植物形成一種互利共生的關系，鐵皮石斛為蘭科植物，內(nèi)生菌是普遍存在的，內(nèi)生菌在其生長過程中發(fā)揮了重要作用[9-11]。試驗材料所用的鐵皮石斛內(nèi)生菌為細菌，存在于接種前期，植株生長起來后，逐漸消失，后期肉眼觀察不到。Amp 是常見的抗生素，對抑制細菌的生長具有一定作用[12]，Amp 的添加抑制了鐵皮石斛內(nèi)生菌的生長，紅桿鐵皮石斛在添加Amp 的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出促進，T4 則極顯著的促進青桿鐵皮石斛叢生芽增殖，而生長在T3 培養(yǎng)基中出現(xiàn)了抑制，抑制原因尚不明確。土豆泥的添加使培養(yǎng)基中氮源、碳源含量增加，給內(nèi)生菌營造了良好的生長條件，內(nèi)生菌與植株間的平衡被打破，紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛莖段易死亡，叢生芽難以誘導。也有報道稱土豆泥能夠促進植株株高生長，但不利于分蘗[13]，這在紅桿鐵皮石斛中表現(xiàn)明顯。香蕉泥也會使內(nèi)生菌增加，但增加量沒有土豆泥培養(yǎng)基多。香蕉泥有助于鐵皮石斛株高的生長以及根系的形成。蔣林等[14]、羅煥明等[15]都在研究添加物對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響中發(fā)現(xiàn)，香蕉有利于生根。土豆泥和香蕉泥中的青桿鐵皮石斛、紅桿鐵皮石斛出現(xiàn)紅色葉片，可能是內(nèi)生菌含量的增多，對植株產(chǎn)生脅迫作用，花青素含量增加。

（4）紅桿鐵皮石斛與青桿鐵皮石斛在生長上具有一定差異性。在組織培養(yǎng)的過程中，二者的表皮顏色并未出現(xiàn)明顯的區(qū)別。紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖能力弱于青桿鐵皮石斛；株高上二者無較大差異，青桿鐵皮石斛的增殖能力又高于紅桿鐵皮石斛，推測紅桿鐵皮石斛在伸長生長上也略慢于青桿鐵皮石斛。在生根壯苗上，紅桿鐵皮石斛的根系長度和分蘗數(shù)都低于青桿鐵皮石斛，1 級根系數(shù)高于青桿鐵皮石斛。紅桿鐵皮石斛較青桿鐵皮石斛生物含量高，更具有藥用價值[5，16]。紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖能力弱，伸長生長較慢都有利于有效物質的積累。