熒光定量PCR測定HBV DNA室間質評結果的回顧分析*

李育敏，闞麗娟，張水蘭，湯花梅，李方勇，許曉清，熊 丹，張秀明

(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣州深圳 518001)

室間質量評價(EQA)是臨床實驗室保證檢驗結果可靠和質量評價及改進的重要手段。ISO 15189：2012和CNAS-CL36：2012《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》[1]規(guī)定臨床基因擴增實驗室應按照CNAS-RL02《能力驗證規(guī)則》[2]的要求參加相應的能力驗證/室間質評。EQA成績可以反映實驗室的檢測水平，實驗室通過參加EQA獲得滿意的質量評價結果來證明檢測系統(tǒng)的準確性和可靠性。HBV DNA項目的EQA數(shù)據(jù)統(tǒng)計是以靶值和上下限作為分析指標，結果對數(shù)在上下限內則評價通過，但合格的數(shù)據(jù)也可能存在潛在的系統(tǒng)誤差和/或隨機誤差，實驗室除分析不及格的原因、查找誤差來源和采取糾正措施外，還應對合格數(shù)據(jù)進行分析，識別可能存在的潛在誤差，以及早采取糾正和預防措施，避免失控發(fā)生，從而提高實驗室質量管理水平。使用Z比分數(shù)(或稱標準差指數(shù)SDI)和質控多規(guī)則分析臨床生化和免疫定量檢測的EQA結果已被廣泛的認可[3-6]，但在臨床分子診斷應用中的報道較少。本研究通過探討HBV DNA定量檢測的EQA結果分析，為EQA定量數(shù)據(jù)性能指標在臨床分子診斷中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1 材料 HBV DNA定量檢測EQA血清樣品由衛(wèi)計委臨檢中心發(fā)放，每年發(fā)放2次，每次測定5個批號的樣本，2016～2018年上半年共測定25份樣本。質控樣品按照說明書保存于-15℃以下。

1.2 試劑與儀器 湖南圣湘生物科技有限公司的HBV DNA熒光定量PCR試劑盒和羅氏cobas○Rz480熒光定量PCR分析儀。

1.3 檢測方法 將質控樣品和臨床標本等同處理和檢測，室內質控在控時數(shù)據(jù)可接受。

1.4 評價方法

1.4.1 PT得分統(tǒng)計：參照美國CLIA’88 PT評價方法，單個測定值評價：測定值落在上下限內為可接受結果，否則為不可接受結果；單次質評：針對某一項目PT得分(%)=該項目的可接受結果數(shù)/該項目的總測定次數(shù)×100。PT≥80%為當前性能滿意；總評：連續(xù)三次為滿意，則累積性能為成功；連續(xù)兩次為不滿意或連續(xù)三次中有兩次為不滿意則為不成功。

2結果

2.1 PT評分統(tǒng)計 2016～2018年上半年我室測定的25份HBV DNA項目EQA樣本結果及評分見表1。2016～2018年上半年5次EQA結果的PT得分均為100%，當前性能為滿意，累積性能為成功。

表1 2016～2018年上半年EQA HBV DNA項目PT結果及Z比分數(shù)統(tǒng)計(LOG值)

注：D1．結果與靶值差值；D2．結果與同方法組均值差值；s.同方法組均值標準差。

2.2 休哈特控制圖 將2016～2018年上半年的EQA HBV DNA檢測樣本中的15份陽性結果繪制于休哈特控制圖上，所有結果均在百分比允許差值限(-100%～100%)內，見圖1。將本室結果與EQA靶值比較，2016年第1次和第2次結果出現(xiàn)連續(xù)正偏倚，但偏倚較小，且不精密度??；2017年～2018年的3次結果分布于“0”線兩側，但不精密度較2016年增大(圖1A)。而將本室結果與EQA同方法組均值比較，5次結果則出現(xiàn)連續(xù)正偏倚，且后面兩次不精密度增大(圖1B)。

注：A.結果與EQA靶值比較；B.結果與同方法組均值比較；161.2016年第1次；162.2016年第2次；171.2017年第1次；172.2017年第2次；181.2018年第1次。

圖12016～2018上半年5次EQAHBVDNA項目的百分比允許差值圖

3討論室間質量評價數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法有變異指數(shù)得分(variance index score，VIS)法、PT得分法和Z比分數(shù)(SDI)法。我國現(xiàn)已不再采用VIS法，而且HBV DNA項目也無推薦的選定變異系數(shù)(CCV)。本實驗室首先參照美國CLIA’88 PT評價方法對2016～2018年上半年HBV DNA項目EQA結果進行分析，從單個測定值、單次質評和總評三個層次來看，所有測定結果均在允許上下限內，為可接受結果，5次EQA結果的PT得分均為100%，當前性能為滿意，累積性能為成功。通過PT得分方法可判斷不及格的結果和不成功的PT成績，但是合格的結果也可能存在潛在的系統(tǒng)誤差和/或隨機誤差。

臨床實驗室除分析EQA不及格的原因外，還應對合格數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。本實驗室進一步采用Z比分數(shù)(SDI)法分析EQA合格數(shù)據(jù)，以監(jiān)控EQA結果的趨勢及識別潛在誤差。結果表明各批次數(shù)據(jù)均│Z│<2.0，結果滿意；但結合SDI和EA，按照EQA質控多規(guī)則分析[8-9]，違背規(guī)則21.0SDI和1150%EA，提示可能存在系統(tǒng)誤差，需采取糾正和預防措施改進實驗室的檢驗質量。穩(wěn)健的Z比分數(shù)統(tǒng)計方法能更好消除離群值的影響[3，10]，但是通常實驗室無法獲得第25和第75百分位數(shù)來計算四分位間距(IQR)，因此可直接采用傳統(tǒng)的Z比分數(shù)(SDI)結合質控多規(guī)則分析EQA結果。由于Z比分數(shù)代表實驗室測定結果與同方法組均值的相對偏離距離，因此Z比分數(shù)的大小體現(xiàn)了檢驗結果的可比性，是對評價項目的標準化估計且適用于分析各種結果值。

休哈特控制圖可清晰的展示每次結果的可比性和幫助理解數(shù)據(jù)的分析結果。將測定結果與均值的相對偏離轉換為百分比允許差值，即可采用標準化的方式將多次結果繪制于休哈特圖上。圖1顯示將測定結果與EQA靶值比較，2016年兩次結果出現(xiàn)連續(xù)正偏倚，但偏倚較小，2017年第1次結果則偏倚降低，5次結果百分比允許差值均值分布于“0”線兩側，但后3次結果不精密度增加；而將結果與EQA同方法組均值比較，5次結果出現(xiàn)連續(xù)正偏倚，且2018年第1次結果明顯偏上，提示可能存在系統(tǒng)誤差。由于EQA樣本經(jīng)過加工，與臨床樣本存在差異，因此應按方法學或其他方式進行分組統(tǒng)計，以同方法組均值或中位數(shù)來計算差值。本室的數(shù)據(jù)分析也提示測定結果與同方法組均值進行統(tǒng)計較EQA靶值存在明顯系統(tǒng)誤差，表明與同方法組均值進行比較更有助于實驗室及時、客觀地識別潛在誤差。

綜上所述，臨床實驗室應首先評價PT成績，如不及格則分析原因、查找誤差來源及采取糾正措施；其次采用Z比分數(shù)(SDI)結合EQA質控多規(guī)則分析合格數(shù)據(jù)，識別可能存在的潛在誤差；第三，采用PT得分和Z比分數(shù)報表(表1)展示EQA統(tǒng)計數(shù)據(jù)，既體現(xiàn)檢驗結果的可比性(Z比分數(shù)大小)，又可采用評價限對差值(D)指標進行評價；第四，采用休哈特控制圖顯示每次EQA結果的可比性，利于結果的比較?？傊瑢嶒炇铱刹捎靡陨蠋追N評價方法綜合評價EQA結果，以指導實驗室進行持續(xù)質量改進。