潛在食源性致病菌弓形菌在食品中的分布及檢測研究進(jìn)展

吳瑜凡，王 翔，崔思宇，邵景東,*

（1.張家港出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇 張家港 215600；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

弓形菌屬（Arcobacter spp.）是一類新型的人畜共患的食源性和水源型病原菌，因其與彎曲菌形態(tài)相似且親緣關(guān)系相近，最早被劃分在彎曲菌屬，稱為“氧氣耐受的彎曲菌”。1991年Vandamme等通過親緣性比對，將其劃分為獨立的分支——弓形菌屬[1]。目前弓形菌屬內(nèi)已發(fā)現(xiàn)和報道的有22 個種（http://www.bacterio.net/arcobacter.html），其中有10 種弓形菌分離于自然環(huán)境，如Arcobacter nitrofigilis分離自植物根際，具有固氮功能，最初被稱為Campylobacter nitrogigilis[2]，隨后劃入弓形菌屬[1]；另外12 種均分離自人源或動物源，其中最受關(guān)注的是布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）、斯氏弓形菌（Arcobacter skirrowii）和嗜低溫弓形菌（Arcobacter cryaerophilus），據(jù)報道這3 種菌與人類和動物的腹瀉、菌血癥等疾病密切相關(guān)。布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）是最為常見的弓形菌屬致病菌，可以引起人類的腸炎、嚴(yán)重腹瀉、敗血癥和菌血癥等[3]。2002年國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會將弓形菌定為對人類健康有嚴(yán)重危害類微生物[4]，2007年北歐食品分析委員會專家也針對弓形菌的現(xiàn)狀和相關(guān)研究做了專項技術(shù)報告[5]。雖然針對弓形菌的報道逐年增加，然而相較于其他食源性致病菌，對弓形菌的研究尚處于起步階段，國內(nèi)對于該菌的報道也相對較少。本文對弓形菌在食品中的污染現(xiàn)狀、流行病學(xué)特點及弓形菌的實驗室檢測等相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為廣大研究者提供有價值的信息。

1 弓形菌在食品中的分布

弓形菌在形態(tài)上與彎曲菌非常相似，都屬于ε-變形菌綱。弓形菌通常大小為（1～3 μm）×（0.2～0.9 μm），呈彎曲狀S形或螺旋形，革蘭氏陰性，端生鞭毛，有運動性，在顯微鏡下可見其進(jìn)行螺旋狀翻滾或突進(jìn)運動。在血瓊脂上30 ℃好氧培養(yǎng)48～72 h后，長出直徑為2～4 mm大小的灰白色圓形菌落[3]。多數(shù)菌株在液體培養(yǎng)基中只能觀察到微弱的生長。弓形菌基因組DNA的G+C含量范圍在27%～30%。雖然與彎曲菌屬細(xì)菌親緣關(guān)系較近且形態(tài)相似，但是其生長特性有明顯差異，相較于彎曲菌，弓形菌具有更廣的生長溫度范圍和更強的氧氣耐受性，因而較彎曲菌更易存活。弓形菌可以在15～37 ℃的條件下生長，最適生長溫度為30 ℃，較彎曲菌的最適生長溫度（37～42 ℃）更低。另外，弓形菌最適生長環(huán)境為微好氧環(huán)境（氧氣體積分?jǐn)?shù)3%～10%），在正常有氧條件下和厭氧條件下均可生長[6]。因此，生長溫度和氧氣耐受性通常是鑒別弓形菌屬和彎曲菌屬的重要指標(biāo)。

近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)弓形菌在肉制品、奶制品、海產(chǎn)品以及蔬菜中都有廣泛分布。研究者們分別對弓形菌在禽肉[7-9]、牛肉[10-12]、豬肉[13-14]、羊肉[15-16]、乳制品[17-18]、海產(chǎn)品[13-14,19-20]等不同動物肉制品中的分布進(jìn)行了研究。Hsu等根據(jù)10 年（2004—2014年）全球范圍內(nèi)弓形菌的調(diào)查數(shù)據(jù)對弓形菌在這些食品中的分布進(jìn)行了總結(jié)并排序：乳制品（36.4%）＞豬肉（36.3%）＞海產(chǎn)品（32.3%）＞牛肉（31.2%）＞禽肉（26.4%）＞羊肉（24.9%）＞蔬菜（14%）[21]。但是，也有研究表明，弓形菌分離自豬肉、禽肉及相關(guān)制品的概率要大于其分離自牛羊肉及相關(guān)制品[21]。Rivas等在從澳大利亞超市和屠宰場采樣得到的雞肉糜餡、豬肉餡、牛肉餡和羊肉餡中分離到多株弓形菌，其中雞肉樣品中陽性率最高，高達(dá)73%，其次是豬肉、牛肉和羊肉[13]。根據(jù)Giacometti等對意大利奶牛場的研究，弓形菌在乳制品中較高的發(fā)現(xiàn)率可能與其在乳制品生產(chǎn)環(huán)境中較高的存在率有關(guān)[23]。與彎曲菌不同，弓形菌能夠在有氧的條件下生長，其生理特性使弓形菌在食品加工、動物屠宰環(huán)境中大量存在[12,24-25]。有研究者通過分子生物學(xué)的方法對弓形菌進(jìn)行分子分型和溯源研究，發(fā)現(xiàn)分離自零售食品與分離自食品加工設(shè)備上的弓形菌通常聚為一類，這說明加工過程中的環(huán)境污染是生鮮食品中弓形菌污染的主要原因之一[26]。另外，在低溫保存（0～10 ℃）的食品中也能分離到弓形菌，Badilla-Ramírez等[8]從智利零售冷藏的雞腿肉中分離到21 株弓形菌，表明弓形菌在較低冷藏溫度下仍然能夠存活。最近的研究表明，在蔬菜中也發(fā)現(xiàn)弓形菌的存在[25,27-28]。對普通家庭來說，蔬菜生食的幾率較大，因此，通過生食蔬菜導(dǎo)致弓形菌致病可能成為一項潛在的食品安全風(fēng)險。另一個潛在的傳播途徑則是通過海產(chǎn)品，越來越多的報道表明，弓形菌大量存在于新鮮貝類產(chǎn)品中[14,20,29]，Collado等[14]在貝類中分離到11 種弓形菌，其中優(yōu)勢種為布氏弓形菌，占60.2%，Arcobacter molluscorum占21.2%，這兩種弓形菌在貝類產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)率高達(dá)29.9%。另有研究報道，在蛤類產(chǎn)品中弓形菌的檢出率為23.8%～100.0%，在貽貝中的檢出率為33.3%～50.0%[14,29-30]。Collado等認(rèn)為城市污水的排放是導(dǎo)致弓形菌在貝類產(chǎn)品中大量存在的主要原因[14]。

弓形菌廣泛分布于環(huán)境中（表1），在地表水、水庫、河流、污水處理廠、井水中都有分離到弓形菌的報道[31-32]。在俄亥俄州的一處海島景區(qū)曾爆發(fā)過由于布氏弓形菌污染水源引起的游客和當(dāng)?shù)鼐用癜l(fā)生集體性腸炎的事件。Merga等采集英國9 個污水處理廠的未處理水樣均檢測出弓形菌，同時發(fā)現(xiàn)布氏弓形菌在城市污水中普遍存在[11]。近年來，越來越多的弓形菌感染案例被證明是由于飲用被弓形菌污染的水源或者食物而引起的，因此食品和飲用水也被視為弓形菌傳播的主要途徑[31,33]。另外，根據(jù)Houf[34]、Fera[35]、Petersen[36]等的報道，布氏弓形菌和嗜低溫弓形菌可以寄生在寵物貓、寵物狗的身上，提示通過動物向人傳播也可能是弓形菌潛在的傳播渠道。

表1 弓形菌在食品中的分布Table 1 Prevalence of Arcobacter in foods

2 流行病學(xué)特點

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

人感染致病性弓形菌（布氏弓形菌和嗜低溫弓形菌）通常會引起腸炎和菌血癥[43-45]。斯氏弓形菌雖然從慢性腸炎病人的腹瀉樣品中分離出，但目前還沒有直接的證據(jù)證明其具有致病性[46]。布氏弓形菌是最為常見的致病性弓形菌，在臨床系統(tǒng)食源性病原菌優(yōu)先級評級中，布氏弓形菌因引起全球性散發(fā)病例較多被劃入“非常重要致病菌”[47]。根據(jù)部分病例報道，弓形菌感染引起的腸炎通?？梢宰杂瑹o需使用抗生素治療[33,46]。而由于弓形菌與空腸彎曲菌形態(tài)以及引起疾病癥狀類似，弓形菌引起的疾病經(jīng)常被誤認(rèn)為是空腸彎曲菌引起，造成弓形菌引起的疾病通常被嚴(yán)重低估。弓形菌感染致病的首次報道是1991年泰國發(fā)生的一起集體性兒童腹瀉事件，從631 份臨床樣本中發(fā)現(xiàn)有15 例為弓形菌感染[48]。在另一份報道中，布氏弓形菌被證明造成10 名兒童反復(fù)性腹部痙攣[49]。很多研究表明，布氏弓形菌與腹瀉、腸痙攣有關(guān)，還有可能引發(fā)菌血癥和急性闌尾炎[45,50-51]。最近，比利時的一份研究表明，在過去8 年間，大約有3.5%曾認(rèn)為是空腸彎曲菌引起的病例其實是由布氏弓形菌引起[52]。

關(guān)于弓形菌的流行病學(xué)調(diào)查資料較少，并不是因為弓形菌感染發(fā)病次數(shù)少，而是由于其較難分離，且與空腸彎曲菌非常相似，因此較難區(qū)分鑒定?，F(xiàn)有的調(diào)查通常認(rèn)為弓形菌的污染有以下兩種途徑：在養(yǎng)殖業(yè)中，由于高密度養(yǎng)殖及對糞污處理的疏忽，弓形菌通常會感染奶牛場的飲用水和新鮮牛奶，從而造成細(xì)菌在新鮮牛奶和飲用水中的循環(huán)增殖[53-54]；而在禽畜屠宰廠中，禽肉制品高比例的弓形菌感染可能來自于加工過程中的加工設(shè)備和工業(yè)用水的污染[55]。

2.2 致病和毒力因子

關(guān)于弓形菌的致病機理和毒力因子的研究進(jìn)展一直較為緩慢，2007年Miller等對于Arcobacter butzleriRM4018的全基因組測序促使該領(lǐng)域的研究踏上一個新的臺階[56]。他們通過對基因組進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)弓形菌存在多個與空腸彎曲菌毒力基因同源的基因；除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)了部分與植物和動物病原體同源的假定毒力基因。目前根據(jù)與其他病原菌的同源比對，初步確定了9 個假定毒力基因：cadF、cj1349、ciaB、mviN、pldA、tlyA、hecA、hecB、irgA。其中cadF和cj1349編碼外膜蛋白，增強與纖維連接蛋白的黏附力[57-58]。ciaB基因在彎曲菌中參與對宿主細(xì)胞的入侵[59]。mviN基因在大腸桿菌中是參與肽聚糖合成的關(guān)鍵基因[60]。pldA基因編碼的外膜磷脂酶A與細(xì)胞溶血活性相關(guān)[55]。編碼溶血素的基因tlyA在空腸彎曲菌中被證明參與上皮細(xì)胞Caco-2的黏附[62]。而在植物和動物病原菌中起非常重要作用的黏附素（絲狀血凝素家族）由hecA基因編碼。hecB基因編碼相關(guān)溶血素蛋白[56]。irgA編碼的鐵離子調(diào)節(jié)外膜蛋白被證明與大腸桿菌的致病性相關(guān)[63]。

2.3 弓形菌的耐藥性

大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類抗生素是用于治療弓形菌腸炎的常用藥物，偶爾也會用到四環(huán)素類，同時氨基糖苷類抗生素也會用于治療一些嚴(yán)重的細(xì)菌感染和多種細(xì)菌的交叉感染。Luangtongkum[64]、Rathlavath[65]等的研究表明，細(xì)菌的耐藥性與長期暴露在這些抗生素環(huán)境中有關(guān)。很多分離自人體、禽肉、豬肉以及食品加工環(huán)境中的弓形菌都被證明對常見的人用和獸用抗生素具有一定的耐藥性。據(jù)報道，弓形菌對甲氧芐氨嘧啶、聯(lián)磺甲氧芐啶以及廣譜β-內(nèi)酰胺類如頭孢菌素類特別是紅霉素、環(huán)丙沙星和氨曲南都有較高的耐受性[39,66]。

Kiehlbauch等對78 株分離自動物和人源的布氏弓形菌進(jìn)行耐藥性篩查，發(fā)現(xiàn)高比例的布氏弓形菌對氨芐青霉素具有耐藥性[67]。另外，分離自環(huán)境、動物和人源的弓形菌對氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、氨基糖苷類、青霉素類、四環(huán)素類等抗生素具有較高比例的耐藥性[68-71]。Son等對分離自雞肉的布氏弓形菌和嗜低溫弓形菌的耐藥性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有71.8%的弓形菌都至少存在兩重或多重耐藥性[72]。另外，他們發(fā)現(xiàn)弓形菌中多重耐藥菌的比例要比空腸彎曲菌高，其中布氏弓形菌中存在多重耐藥性的比例最高，達(dá)72.9%[9]。造成這種高比例的原因可能有兩個方面：一方面，在畜禽飼養(yǎng)過程中抗生素在動物治療和預(yù)防過程中確實存在過度使用或濫用的問題；另一方面，目前缺乏對弓形菌抗生素耐藥性評價的標(biāo)準(zhǔn)。由于缺乏專門針對弓形菌耐藥性折點的判斷標(biāo)準(zhǔn)，研究者采用的弓形菌耐藥性分析方法各異，如采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會建立的針對腸桿菌的耐藥性檢測方法；采用針對葡萄球菌的耐藥性檢測方法[70]；或者采用美國國家抗生素耐藥性檢測體系提供的空腸彎曲菌耐藥性標(biāo)準(zhǔn)[8]?？偠灾?，由于缺乏針對弓形菌耐藥性的檢測標(biāo)準(zhǔn)，造成了目前對于弓形菌耐藥性的真實判斷難度較大，且易造成有些抗生素耐藥的漏判。

2.4 弓形菌耐藥機制

目前的研究表明，弓形菌的耐藥性主要來自于染色體上的基因突變[56,73]，質(zhì)粒上還未發(fā)現(xiàn)任何抗生素耐藥基因[74]。如弓形菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性可能與其基因組中的DNA解旋酶A亞基（GyrA）的基因突變有關(guān)。DNA解旋酶由GyrA和GyrB兩個亞基組成，它可以催化DNA形成負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，通常參與DNA的復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄；該基因上有一個喹諾酮耐藥特征區(qū)，其第254位從胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變可以導(dǎo)致對新生霉素和喹諾酮類抗生素的耐藥性[74]。這種突變在從病人樣本中分離的對環(huán)丙沙星耐藥的兩株布氏弓形菌和一株嗜低溫弓形菌中都有發(fā)現(xiàn)。Miller等通過對弓形菌多重耐藥株RM4018進(jìn)行全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)該菌缺少GyrA亞基特定位點的突變，推測其對喹諾酮的耐藥機制可能在喹諾酮的吸收階段，通過增加細(xì)胞通透性和提高外排泵的活性從而耐藥[56]。對于氯霉素的耐藥性，則是由于基因組中存在cat基因編碼的氯霉素O-乙酰轉(zhuǎn)移酶。同時，弓形菌RM4018對β-內(nèi)酰胺類的耐藥可能與基因組中存在3 個半乳糖苷酶同源基因有關(guān)[56]。對弓形菌的耐藥性及耐藥機制的研究目前尚處于起步階段，仍存在很多空白。但是從已有的研究中可以看出，弓形菌耐藥現(xiàn)狀較為嚴(yán)重，這與抗生素的過度使用和濫用密不可分。為了控制弓形菌耐藥菌株的不斷增加，需要我們從農(nóng)畜用藥到人類公共醫(yī)療中對抗生素的使用更為慎重和嚴(yán)格。

3 弓形菌的實驗室檢測方法

對于弓形菌的實驗室檢測根據(jù)檢測的原理通常分為兩種方法：培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法。自1977年Ellis等[75]首次建立了該菌屬的分離方法以來，已開發(fā)出了許多不同的分離方法。總體來說，通過培養(yǎng)進(jìn)行弓形菌分離通常是一個較為繁瑣的過程，需要一系列的富集培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和非選擇培養(yǎng)基，通常需要4～5 d。弓形菌第一次被分離是在一次采用半固體培養(yǎng)基分離鉤端螺旋體的過程中[75]。此后，研究者采用各種不同的分離方法對弓形菌進(jìn)行分離。在近幾年的報道中，弓形菌的分離方法主要采用的是兩步法：首先采用液體增菌培養(yǎng)基進(jìn)行富集；再利用固體選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化[13]。用于增菌的液體培養(yǎng)基主要有：弓形菌特異性培養(yǎng)基（弓形菌培養(yǎng)基添加頭孢哌酮、兩性霉素B和替考拉寧）、彎曲菌增菌培養(yǎng)基、AEB培養(yǎng)基（弓形菌增菌培養(yǎng)基添加頭孢哌酮、兩性霉素B和替考拉寧）等。增菌后通過選擇性平板或纖維素過濾的方法進(jìn)行菌株分離，常用的選擇性平板有：改性木炭頭孢哌酮脫氧膽酸瓊脂（modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar，mCCDA）、彎曲菌選擇性培養(yǎng)基（mCCDA添加頭孢哌酮和兩性霉素B）、Skirrow瓊脂、Butzler培養(yǎng)基、CIN瓊脂等。Merga等綜合了近幾年分離弓形菌的方法，對5 種方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明采用Arcobacter-specific broth培養(yǎng)基進(jìn)行富集增菌，然后采用mCCDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化具有較好的分離弓形菌的效果，可以分離到最多的弓形菌，且對其沒有選擇性[15]。

由于分離培養(yǎng)的方法所需試劑繁多、成本較高，對操作人員要求高，培養(yǎng)結(jié)果易受多種因素影響，檢驗周期通常需要5～7 d，不利于食源性突發(fā)疫情的快速診斷。采用分子生物學(xué)方法對弓形菌進(jìn)行檢測具有快速、準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)勢。目前應(yīng)用較多的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），很多研究者都相繼采用PCR法對樣品中的弓形菌進(jìn)行檢測[76-78]。其中，以Houf等使用的以16S rRNA和23S rRNA作為靶基因檢測布氏弓形菌、嗜低溫弓形菌和斯氏弓形菌的多重PCR法應(yīng)用最為廣泛[79]。Samarajeewa等[80]對高通量測序、變性梯度凝膠電泳、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和克隆建庫測序4 種新型的檢測方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)所有這些方法都能夠從已知的混合菌群中檢出弓形菌。Levican等[81]于2013年對已發(fā)表的弓形菌PCR檢測方法進(jìn)行了比較和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)近年來隨著GenBank中16S rRNA和23S rRNA基因序列資源的不斷豐富，Houf[79]報道的3 對引物的特異性大大降低，已無法保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，16S rRNA和23S rRNA也不再適合作為分辨布氏弓形菌、嗜低溫弓形菌和斯氏弓形菌的的靶基因。

從目前的檢測技術(shù)來看，單一檢測技術(shù)往往在靈敏度或者準(zhǔn)確性上有所局限，越來越多的研究者傾向于采用多種檢測方法相結(jié)合來進(jìn)行弓形菌的檢測。Antolin等采用PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法對禽肉中的弓形菌進(jìn)行檢測[82]。Vergis等采用16S rRNA基因PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶（EcoRI、HindIII和SalI等）酶切，可以分辨包括弓形菌在內(nèi)的8 種食源性病原菌（弓形菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、弧菌、彎曲菌和耶爾森氏菌）[83]。Figueras等采用PCR結(jié)合RFLP方法（MseI酶切），能夠分辨弓形菌屬內(nèi)的6 種弓形菌，其中包括嗜低溫弓形菌的兩個亞型[84]。弓形菌屬細(xì)菌增加至17 種后，F(xiàn)igureras等采用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)可以分辨出該屬內(nèi)的10 種弓形菌，而另外7 種采用MseI酶切無法分辨的菌種可采用MnlI和BfaI酶切區(qū)分，該研究表明弓形菌屬內(nèi)的不同菌種在基因組水平上具有差異性[85]。Abdelbaqi等通過熒光定量PCR結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，在病人樣本中檢測到布氏弓形菌陽性[86]。通常情況下，從病例樣本中采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分離到布氏弓形菌和嗜低溫弓形菌的概率為0.1%～3.0%[87]。分子生物學(xué)技術(shù)作為一種不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)，擺脫了傳統(tǒng)弓形菌檢測鑒定過程中的培養(yǎng)條件、時間以及表型特征鑒定的限制，通常能夠得到更為靈敏和準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，同時也大大節(jié)約了檢測時間（表2）。但是由于其僅針對細(xì)菌核酸進(jìn)行檢測，難以判斷被檢測細(xì)菌的生存狀態(tài)，因此，能夠快速準(zhǔn)確判斷細(xì)菌的數(shù)量及生存狀態(tài)的檢測方法還有待研究。

表2 弓形菌的分子生物學(xué)檢測方法比較Table 2 An overview of molecular diagnostic assays for the detection of Arcobacters

4 結(jié) 語

弓形菌作為一種新型食源性致病菌，已逐漸引起國內(nèi)外研究者的關(guān)注。本文對近幾年來弓形菌在食品中的分布、流行病學(xué)特點和弓形菌的檢測研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。與其他常見食源性致病菌的研究相比，對弓形菌的研究仍處于起步階段。隨著高通量測序、高分辨率質(zhì)譜等手段在檢測領(lǐng)域的發(fā)展，更快、更準(zhǔn)確的弓形菌檢測方法是今后研究的重要方向。另外，隨著全球?qū)κ称钒踩闹饾u重視和食品安全溯源體系的逐步完善，對弓形菌在食品中的傳播機制和溯源也是今后發(fā)展的重要方向。