24-表油菜素內(nèi)酯對(duì)杏果實(shí)采后抗冷性與可溶性糖含量的影響

張杼潤(rùn)，張瑞杰，趙 津，朱 璇*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniaca L.）在新疆園藝產(chǎn)業(yè)中占重要地位。2016年，新疆杏種植面積達(dá)1.24×109m2,產(chǎn)量達(dá)1.15×106t[1]。杏屬呼吸躍變型果實(shí)，常溫下易發(fā)生腐敗變質(zhì)。低溫貯藏雖可有效抑制杏果實(shí)采后腐爛，但會(huì)導(dǎo)致冷敏性果實(shí)杏發(fā)生生理紊亂，出現(xiàn)冷害現(xiàn)象[2]。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖不僅能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成來(lái)作為植物生長(zhǎng)控制的基礎(chǔ)[3]，還可作為活性氧清除劑，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡，對(duì)植物抗低溫逆境起重要作用[4-5]。如紅樹(shù)莓中糖的積累能增強(qiáng)其抗冷害逆境耐受力[6]。近幾年來(lái)，糖在植物抗冷害脅迫中起到的調(diào)節(jié)作用成為研究熱點(diǎn)。

油菜素內(nèi)酯是一種新型甾體植物生長(zhǎng)激素，它能充分激發(fā)植物內(nèi)在潛能，促進(jìn)生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量，同時(shí)提高植物的抗寒、抗病、抗鹽等能力，使植物的耐逆性增強(qiáng)，被認(rèn)為是第六大類(lèi)植物激素[7-8]。但從植物中提取油菜素內(nèi)酯工藝復(fù)雜，成本昂貴，所以更多使用的是利用麥角甾醇等天然甾體化合物改造合成的油菜素甾體化合物產(chǎn)品，24-表油菜素內(nèi)酯（24-epibrassinolide，EBR）就是其中一種[9]。目前，針對(duì)EBR的研究更多地集中于大豆[10]、黑麥草[11]的抗鹽脅迫，葡萄葉片[12]的抗病害脅迫，及番茄植株[13]的抗弱光脅迫等積極作用，近年來(lái)研究也證實(shí)了EBR能對(duì)桃[14]、茄子[15]果實(shí)冷害進(jìn)行有效控制，關(guān)注點(diǎn)多在冷害控制效果與活性氧代謝的研究上，但EBR對(duì)果實(shí)糖含量和冷害關(guān)系的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以新疆‘賽買(mǎi)提’杏為實(shí)驗(yàn)材料，探究EBR對(duì)杏果實(shí)冷害發(fā)生情況與可溶性糖含量變化及其關(guān)系的影響，為完善低溫脅迫下可溶性糖對(duì)果實(shí)的保護(hù)機(jī)制和采后果實(shí)低溫適應(yīng)性誘導(dǎo)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆‘賽買(mǎi)提’杏采自于新疆庫(kù)車(chē)縣烏恰鎮(zhèn)杏果園。杏果實(shí)硬度用GY-B型果實(shí)硬度計(jì)（探頭直徑4 mm）在果實(shí)赤道部位等距離取3個(gè)點(diǎn)測(cè)定并取平均值，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)用WYT-J型手持糖度儀進(jìn)行測(cè)定，選取硬度在13～15 kg/cm2，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%～12%之間、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，采摘后于12 h之內(nèi)運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬采后生理研究室。

蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖標(biāo)準(zhǔn)品及乙腈（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；EBR（粉劑，純度≥90%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配有RID-10A示差折光檢測(cè)器和LabSolutionsLCsolution色譜工作站） 日本島津公司；GL-20G-2高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 北京永光明儀器廠；DDS-307電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，在0～2 mg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度0.9 mg/L的EBR溶液處理后，‘賽買(mǎi)提’杏冷藏期間各品質(zhì)指標(biāo)表現(xiàn)最優(yōu)，質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)加快果實(shí)腐爛；因此選擇0.9 mg/L作為本實(shí)驗(yàn)處理的質(zhì)量濃度。用減壓滲透[16]的方式處理杏果實(shí)，將浸泡有杏果實(shí)的EBR溶液抽氣減壓至0.05 MPa保持2 min，之后恢復(fù)常壓繼續(xù)浸泡5 min，自然晾干后置于溫度為0 ℃、相對(duì)濕度為90%～95%的冷庫(kù)貯藏。以蒸餾水處理作為對(duì)照組，每處理選用300 個(gè)杏果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.3.2 冷害指數(shù)測(cè)定

參照Wang Zhen等[17]的方法，將杏果實(shí)冷害分為5 級(jí)。其中，0級(jí)：無(wú)冷害發(fā)生；1級(jí)：冷害面積0～5%之間；2級(jí)：冷害面積5%～25%之間；3級(jí)：冷害面積25%～50%之間；4級(jí)：冷害面積大于50%；按公式（1）計(jì)算冷害指數(shù)。每處理觀察100 個(gè)杏果實(shí)，重復(fù)3 次，總共統(tǒng)計(jì)樣本量為300 個(gè)杏果實(shí)。

1.3.3 冷害發(fā)病率測(cè)定

以單個(gè)果實(shí)冷害程度達(dá)1級(jí)及以上計(jì)為發(fā)病果，按式（2）計(jì)算冷害發(fā)病率。每處理觀察100 個(gè)杏果實(shí)，重復(fù)3 次，總共統(tǒng)計(jì)樣本量為300 個(gè)杏果實(shí)。

1.3.4 細(xì)胞膜透性測(cè)定

使用打孔器（直徑5 mm）取杏果肉并切成厚度約2 mm圓片，測(cè)定新鮮圓片浸提液的電導(dǎo)率（L1）和煮沸后果實(shí)圓片的電導(dǎo)率（L0），按式（3）計(jì)算的比值即相對(duì)電導(dǎo)率（Le），以相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)表示細(xì)胞膜滲透率，每處理選果3 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.5 MDA含量測(cè)定

參照曹建康等[18]的方法測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.3.6 可溶性糖含量測(cè)定

采用HPLC測(cè)定可溶性糖含量。提取方法：稱取2.00 g杏果肉樣品，加入4.00 mL超純水冰浴研磨勻漿，后用2.00 mL超純水清洗研缽，轉(zhuǎn)入到離心管中，先超聲提取5 min后轉(zhuǎn)入水浴鍋80 ℃提取15 min，10 000×g離心20 min后取上清液，殘?jiān)映兯笾貜?fù)以上步驟一次，合并上清液，定容于25 mL容量瓶，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。每處理選果3 個(gè)，重復(fù)3 次。

測(cè)定條件：流動(dòng)相為乙腈-水（體積比75∶25），流速為1 mL/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，分析時(shí)長(zhǎng)15 min。檢測(cè)器：RID-10A示差折光檢測(cè)器，色譜柱：Kromasil氨基色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別準(zhǔn)確稱取100 mg蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，梯度稀釋至5.00、2.50、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。差異顯著性分析方法用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理對(duì)杏果實(shí)冷藏期間冷害指數(shù)、冷害發(fā)病率的影響

圖1 EBR處理對(duì)杏果實(shí)冷害指數(shù)（A）和冷害發(fā)病率（B）的影響Fig. 1 Effect of EBR treatment on chilling injury index (A) and chilling injury rate (B) of apricots

如圖1A所示，對(duì)照組在貯藏第21天出現(xiàn)冷害癥狀，EBR處理組較對(duì)照組推后7 d出現(xiàn)冷害現(xiàn)象。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組與處理組冷害指數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且處理組杏果實(shí)冷害指數(shù)始終低于對(duì)照組。到貯藏第42天時(shí)，EBR處理組冷害指數(shù)比對(duì)照組低24.2%（P＜0.05）。說(shuō)明EBR處理可明顯降低杏果實(shí)貯藏期間冷害指數(shù)。

由圖1B可知，整個(gè)貯藏期EBR處理杏果實(shí)冷害發(fā)病率始終低于對(duì)照組，到貯藏期結(jié)束時(shí)，對(duì)照組杏果實(shí)冷害發(fā)病率為42.3%，EBR處理組為31.5%，比對(duì)照組低25.5%（P＜0.05）。說(shuō)明EBR處理可有效抑制杏果實(shí)冷害發(fā)病率，延緩杏果實(shí)冷害的發(fā)生。

2.2 EBR處理對(duì)杏果實(shí)冷藏期間細(xì)胞膜滲透率、MDA含量的影響

圖2 EBR處理對(duì)杏果實(shí)細(xì)胞膜滲透率（A）和MDA含量（B）的影響Fig. 2 Effect of EBR treatment on cell membrane permeability (A) and malondialdehyde content (B) of apricots

果蔬組織受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能都受到影響，往往表現(xiàn)為細(xì)胞膜透性增加和電解質(zhì)外滲[19]，由圖2A可知，EBR處理后杏果實(shí)細(xì)胞膜滲透率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且處理組始終顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），在第28、42天分別比對(duì)照組低16.8%、17.4%，說(shuō)明EBR處理可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，有效抑制杏果實(shí)冷害的發(fā)生。

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一[20]，由圖2B可知，整個(gè)低溫貯藏期間EBR處理組MDA含量始終低于對(duì)照組，到第28天時(shí)，EBR處理組與對(duì)照組MDA含量分別達(dá)到0.68、0.84 nmol/g，隨后差距逐漸加大，到貯藏期結(jié)束時(shí)EBR處理組MDA含量比對(duì)照組低22.3%（P＜0.05）。表明EBR處理能有效抑制杏果實(shí)冷藏期間膜脂過(guò)氧化進(jìn)程，從而延緩衰老。

2.3 EBR處理對(duì)杏果實(shí)冷藏期間可溶性糖含量的影響

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)樣中各組分依次的出峰順序?yàn)楣?、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，保留時(shí)間分別7.298、8.048、8.532、11.686 min。樣品可溶性糖HPLC結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig. 3 High performance liquid chromatogram of mixed saccharide standards

圖4 鮮杏果實(shí)樣品可溶性糖成分的HPLC圖Fig. 4 High performance liquid chromatogram of soluble saccharides in apricots

圖5 EBR處理對(duì)杏果實(shí)果糖（A）、山梨醇（B）、葡萄糖（C）、蔗糖（D）含量的影響Fig. 5 Effect of EBR treatment on the contents of fructose (A),sorbitol (B), glucose (C) and sucrose (D) in apricots

如圖5A所示，果糖含量在整個(gè)貯藏期間呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，且EBR處理組杏果實(shí)果糖含量始終高于對(duì)照組。在貯藏前期，果糖含量保持平緩上升，對(duì)照組在21 d后，上升幅度陡然增大，而EBR處理組則推遲7 d后上升幅度顯著加大。第35、42天時(shí)，處理組果糖含量分別比對(duì)照組高49.5%和19.4%（P＜0.05）。表明EBR處理可明顯增加低溫貯藏期間杏果實(shí)果糖含量。

杏果實(shí)貯藏中后期（14～21 d）EBR處理組與對(duì)照組山梨醇含量變化趨勢(shì)相同（圖5B），呈降-升-降的趨勢(shì)，且EBR處理組含量始終高于對(duì)照組，在第7天時(shí)出現(xiàn)最大差異，此時(shí)處理組比對(duì)照組高18.2%（P＜0.05），貯藏到42 d時(shí)，EBR處理組與對(duì)照組山梨醇含量均達(dá)到最低，表明EBR處理可增加杏果貯藏期間山梨醇含量，但貯藏結(jié)束時(shí)，兩組山梨醇含量比初始均稍有下降。

葡萄糖含量經(jīng)EBR處理后在貯藏前期無(wú)明顯變化（圖5C），21 d后逐漸增大，直到貯藏結(jié)束時(shí)達(dá)到47.4 g/kg。對(duì)照組果實(shí)葡萄糖含量在冷藏開(kāi)始時(shí)先逐步下降，14 d時(shí)達(dá)最低值后緩慢上升，到貯藏結(jié)束時(shí)比EBR處理組低31.2%（P＜0.05）。表明EBR處理可顯著增加低溫貯藏期間杏果實(shí)葡萄糖含量。

蔗糖含量變化與其他糖分相反（圖5D），EBR處理后蔗糖含量始終低于對(duì)照組。0 d時(shí)兩組蔗糖含量為28.8 g/kg，到第7天時(shí)，EBR處理組蔗糖含量上升到40.4 g/kg，低于對(duì)照組7.8%（P＜0.05），隨后下降到最低值22.1 g/kg（21 d時(shí)），低于對(duì)照組9.7%（P＜0.05），之后緩慢上升，到貯藏結(jié)束時(shí)低于對(duì)照組13.1%（P＜0.05）。對(duì)照組變化趨勢(shì)與處理組相同。

3 討 論

可溶性糖是影響果實(shí)風(fēng)味與質(zhì)量的重要因素之一[21]。在本研究中測(cè)得杏果實(shí)中可溶性糖主要有果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖，與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果[22]類(lèi)似。EBR處理增加了杏果實(shí)冷藏期間果糖、山梨醇和葡萄糖含量，EBR處理對(duì)杏果實(shí)冷藏期間品質(zhì)的保持起到積極作用。李園園[23]、柳巧禛[24]等的研究也表明EBR處理保持了草莓、‘赤霞珠’葡萄果實(shí)的貯藏品質(zhì)。同時(shí)，EBR處理明顯降低了杏果實(shí)冷藏期間冷害指數(shù)、冷害發(fā)病率、MDA含量與細(xì)胞膜滲透率，有效抑制了杏果實(shí)冷害的發(fā)生，而可溶性糖除了是果實(shí)品質(zhì)的重要組成，對(duì)保護(hù)果實(shí)免受冷應(yīng)激損傷同樣起重要作用。已有的研究表明，桃在5 ℃貯藏28 d時(shí)出現(xiàn)冷害現(xiàn)象，較沒(méi)出現(xiàn)冷害的0 ℃貯藏果實(shí)表現(xiàn)出更低的蔗糖含量和較高的葡萄糖和果糖含量[25]；1 ℃貯藏時(shí)冷害較輕的‘寧海白’枇杷比冷害嚴(yán)重的‘大紅袍’枇杷葡萄糖、果糖含量高[26]；一氧化氮（NO）熏蒸李果實(shí)較非熏蒸組，果糖和葡萄糖含量增高，蔗糖含量降低，冷害癥狀顯著降低[27]。山梨醇代謝在薔薇科植物中起重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果抗寒性與山梨醇含量呈正相關(guān)[28]。以上結(jié)論均證實(shí)糖在采后果實(shí)抗低溫逆境脅迫中起重要作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一，一方面葡萄糖與果糖作為主要還原糖，其積累可以緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高膜的穩(wěn)定性，抵抗低溫脅迫造成的損傷[29]。其中葡萄糖可通過(guò)戊糖磷酸途徑清除活性氧[30]，還可作為抗壞血酸合成的前體物，誘導(dǎo)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)減緩果實(shí)冷害的發(fā)生[31]，這在桃[25]、枇杷[32]、芒果[33]中已經(jīng)得到證實(shí)。而生物膜系統(tǒng)的損傷在膜脂相變理論[34]中是植物遭受低溫逆境時(shí)的原初反應(yīng)，這將導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的損失與電解質(zhì)滲透及膜脂過(guò)氧化的增加。另一方面，糖物質(zhì)積累可調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持細(xì)胞水分，穩(wěn)定磷脂雙分子層的原始結(jié)構(gòu)，減輕低溫對(duì)生物膜的損傷[35]。MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，過(guò)多的MDA會(huì)影響膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，擾亂正常的生理代謝[20]。在本研究中EBR在提高果糖、山梨醇和葡萄糖含量的同時(shí)降低MDA含量與細(xì)胞膜滲透率，緩解了冷害的發(fā)生。

在本研究中，杏果實(shí)經(jīng)EBR處理后蔗糖含量有所下降，Wang Zhen等[17]針對(duì)鮮食吊干杏的研究表明，草酸處理能降低蔗糖含量和冷害發(fā)生，與本研究結(jié)論相似。Shao Xingfeng等[32]研究表明，熱處理后枇杷果實(shí)冷藏期間蔗糖含量降低，冷害程度減輕；而Holland等[36]則研究得出熱處理可增加蔗糖含量而減輕冷藏期間橘子冷害的發(fā)生。因此，關(guān)于蔗糖在植物抗冷害中起的作用可能因果實(shí)品種、成熟度等的不同有所變化，至于哪一種糖在抗低溫脅迫中起最重要作用尚未定論。

果實(shí)低溫貯藏期間不同類(lèi)型糖的變化模式非常復(fù)雜，糖對(duì)抗冷脅迫的調(diào)控機(jī)理尚不明確，還需應(yīng)用分子技術(shù)，研究糖代謝中關(guān)鍵酶的基因組學(xué)與相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討糖作為信號(hào)分子對(duì)果實(shí)抗低溫的調(diào)控作用，以此為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供助力。

本研究表明，EBR處理可明顯降低杏果實(shí)低溫貯藏期間冷害指數(shù)、冷害發(fā)病率與MDA含量、細(xì)胞膜透性，增強(qiáng)杏果實(shí)抗冷性，這可能與果糖、山梨醇、葡萄糖含量的增加密切相關(guān)。