辣木籽抗氧化肽的制備及其對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用

林戀竹，朱啟源，趙謀明*

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

辣木（Moringa oleifera）是多年生熱帶落葉喬木，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)云南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地區(qū)均有大面積種植，資源量極其豐富[1]。辣木籽含有豐富的脂質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.8%～41.2%）和蛋白質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.4%～38.3%）[2]。目前，針對(duì)辣木籽油高效提取方法的研究較多，取得了較好的進(jìn)展[3-6]。辣木籽蛋白中Val、Leu、Ile、His等多種氨基酸的含量接近或遠(yuǎn)高于聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)模式譜，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源加以開(kāi)發(fā)[7-9]。然而，目前針對(duì)辣木籽蛋白的精深加工技術(shù)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究較少。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）所造成的氧化損傷會(huì)導(dǎo)致衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等的發(fā)生發(fā)展[10-11]?！敖】抵袊?guó)2030”已列入國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略，保健食品產(chǎn)業(yè)是健康戰(zhàn)略的重要組成部分，高品質(zhì)的保健食品具有巨大的市場(chǎng)需求。因此，以辣木籽為原料通過(guò)食品加工技術(shù)開(kāi)發(fā)具有抗氧化活性的生物活性肽用作保健食品配料，可為辣木籽肽作為高效抗氧化劑應(yīng)用于保健食品提供理論與方法指導(dǎo)。

本研究采用酶法制備辣木籽水解物，以抗氧化活性為跟蹤指標(biāo)，通過(guò)乙醇分級(jí)沉淀和大孔樹(shù)脂柱層析法定向制備辣木籽抗氧化肽，構(gòu)建模擬胃、腸道消化模型，評(píng)價(jià)辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），解析消化物中多肽組成與結(jié)構(gòu)，研究經(jīng)胃、腸道消化后的辣木籽抗氧化肽對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞溶血的抑制作用，基于生物可接受度評(píng)價(jià)辣木籽肽的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

辣木籽 廣東華谷辣木生物科技有限公司。

大鼠 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020）。

N S 3 7 0 7 1蛋白酶 丹麥諾維信公司；熒光素鈉、2,2’-偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）、水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、谷胱甘肽（glutathione，GSH） 美國(guó)Sigma公司；pH 7.4 basic磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（1×） 美國(guó)Thermo Scientific公司；XAD-16大孔樹(shù)脂 北京慧德易科技有限責(zé)任公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、氰化高鐵血紅蛋白試劑盒 南京建成生物工程研究所；純肽（Gln-Met、Leu-Phe） 吉爾生化（上海）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；A300全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)GE Healthcare公司；Impact II四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（quadrupole time of fl ight-tandem mass spectrometry，QTOF-MS/MS）儀 德國(guó)Bruker公司；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀 美國(guó)Waters公司；KND-2C凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；UV-754紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽抗氧化肽的制備

1.3.1.1 酶法制備辣木籽水解物

辣木籽干燥后脫殼，粉碎過(guò)80 目篩，稱(chēng)取辣木籽粉1 600 g，100 ℃蒸汽處理20 min，按料液比1∶6加入蒸餾水，攪拌均勻。用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混懸液至pH 8.0，60 ℃攪拌1 h。調(diào)節(jié)至pH 8.0，加入辣木籽粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的NS37071蛋白酶，55 ℃酶解24 h后沸水浴中滅活15 min，冷卻至室溫，10 000×g離心30 min，用移液槍吸除油層后取上清液，55 ℃減壓濃縮，取100 mL冷凍干燥，得辣木籽水解物。收集剩余的濃縮液，備用。

1.3.1.2 乙醇分級(jí)沉淀

在1.3.1.1節(jié)濃縮液中加入一定體積的無(wú)水乙醇，使體系中乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為20%，攪拌均勻后4 ℃靜置12 h，4 500×g離心30 min，得到沉淀物1和上清液1，將沉淀物1溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，冷凍干燥，得20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）醇沉組分。將上清液1減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇，使體系中乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為40%，攪拌均勻，4 ℃靜置12 h，4 500×g離心30 min，制得沉淀物2和上清液2，將沉淀物2溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，冷凍干燥，得40%醇沉組分。以此類(lèi)推，分別制得60%醇沉組分、80%醇沉組分，收集剩余的上清液，55 ℃減壓濃縮，冷凍干燥，得上清液組分。

1.3.1.3 大孔樹(shù)脂柱層析

取大孔樹(shù)脂XAD-16加入無(wú)水乙醇浸泡12 h，溶脹后抽濾去除乙醇，加入蒸餾水反復(fù)洗滌樹(shù)脂至無(wú)醇味。加入1.0 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，抽濾除去NaOH溶液，并用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹(shù)脂直至洗滌液的pH值為7.0。加入1.0 mol/L HCl溶液浸泡4 h，抽濾除去HCl溶液，并用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹(shù)脂直至洗滌液的pH值為7.0。采用濕法裝柱（2.5 cm×120 cm），上樣后將層析柱放入4 ℃層析柜中靜置12 h；在室溫下依次用蒸餾水以及體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%乙醇進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸，并控制洗脫劑流速為5 mL/min，分別收集洗脫液，55 ℃減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥，得到各洗脫組分。

1.3.2 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.2.1 ORAC測(cè)定

在96 孔板各微孔中分別加入20 μL樣品或75 mmol/L PBS（pH 7.4）（空白對(duì)照），加入120 μL 70 nmol/L熒光素鈉，將96 孔板置于酶標(biāo)儀中，37 ℃孵育15 min，迅速加入60 μL 40 mmol/L AAPH混勻啟動(dòng)反應(yīng)并開(kāi)始測(cè)定（初始熒光強(qiáng)度記為f0）。激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，每1 min讀數(shù)1 次，共讀121 次（熒光強(qiáng)度記為fn，n＝1，2，3，……，121）[12]。將每次讀數(shù)值連成曲線，按式（1）計(jì)算曲線下的面積（AUC）。

配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L Trolox溶液，按以上步驟進(jìn)行測(cè)定，按式（2）計(jì)算Net AUC。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)、Net AUC為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的ORAC，以每克樣品與Trolox擁有相同的ORAC時(shí)相當(dāng)于Trolox的物質(zhì)的量計(jì)（μmol/g）。

式中：AUCsample、AUCblank分別表示樣品、空白對(duì)照曲線下的面積。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

吸取適宜濃度樣品溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度A樣品；用2 mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液，測(cè)定吸光度A對(duì)照；用2 mL無(wú)水乙醇代替DPPH無(wú)水乙醇溶液，測(cè)定吸光度按式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。

配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L Trolox溶液，按以上步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算DPPH自由基清除率，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的DPPH自由基清除能力，以每克樣品與Trolox擁有相同的DPPH自由基清除能力時(shí)相當(dāng)于Trolox的物質(zhì)的量計(jì)（μmol/g）。

1.3.3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 水解氨基酸的測(cè)定

在安瓿瓶中加入10 mg樣品和5 mL 6 mol/L HCl溶液，密封，110 ℃水解24 h，冷卻、過(guò)濾、干燥。加入2 mL乙酸鈉鹽緩沖液（pH 2.0）溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，采用自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定水解氨基酸組成與質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14]。

1.3.5 基于生物可接受度評(píng)價(jià)辣木籽肽的抗氧化活性

1.3.5.1 模擬胃、腸道消化辣木籽抗氧化肽

配制10 mg/mL樣品溶液，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0，加入樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h；用1.0 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)至pH 5.3，接著用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5，加入樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胰酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h。每隔0.5 h取樣，沸水浴中滅活，冷卻，6 000×g離心15 min，取上清液，測(cè)定ORAC，以每克樣品蛋白與Trolox擁有相同的ORAC時(shí)相當(dāng)于Trolox的物質(zhì)的量計(jì)（μmol/g）。取消化4 h的消化物離心，取上清液冷凍干燥，制得辣木籽抗氧化肽消化物[15]。

1.3.5.2 UPLC-QTOF-MS/MS解析消化物中多肽組成與結(jié)構(gòu)

UPLC條件：ACQUITY UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，流速200 μL/min。洗脫劑由體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫程序：0 min，70% A；0～6 min，70%～40% A；6～7 min，40%～20% A；7～8 min，20%～70% A；8～10 min，70% A。進(jìn)樣量1 μL。MS條件：掃描范圍m/z 50～2 000；正離子模式；毛細(xì)管電壓3 500 V；霧化器壓力5×104Pa；干燥氣（氮?dú)猓┝魉? L/min；干燥器溫度200 ℃；掃描模式：auto MS/MS模式。利用Data Analysis 4.3軟件解析多肽結(jié)構(gòu)。

1.3.5.3 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用

大鼠紅細(xì)胞懸液配制：取健康大鼠腹主動(dòng)脈血液，4 ℃、1 200×g離心10 min，去除上層血漿和中部的白膜層（血小板、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞），用預(yù)冷的pH 7.4 basic PBS（1×）洗滌底層紅細(xì)胞，并配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%大鼠紅細(xì)胞懸液[16]。

溶血率測(cè)定：取200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%紅細(xì)胞懸液，分別加入10 μL終質(zhì)量濃度為250 μg/mL（低劑量，L）、625 μg/mL（中劑量，M）、1 250 μg/mL（高劑量，H）的樣品溶液或生理鹽水，37 ℃預(yù)保護(hù)30 min；加入200 μL 400 mmol/L AAPH溶液或生理鹽水，37 ℃孵育1.5 h，輕輕吹打，從中吸取兩份150 μL反應(yīng)液：一份加入450 μL生理鹽水，混勻后4 ℃ 1 200×g離心10 min，取上清液，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A；另一份加入450 μL雙蒸水，混勻后4 ℃ 1 200×g離心10 min，取上清液，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0，以不加AAPH、不加樣品為正常組，以加AAPH、不加樣品為模型組。按式（4）計(jì)算溶血率。

高鐵血紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、SOD活力測(cè)定：取紅細(xì)胞懸液，用pH 7.4 basic PBS（1×）洗滌并4 ℃ 1 200×g離心10 min 2 次，棄去上清液，加入預(yù)冷的雙蒸水使紅細(xì)胞完全溶血，4 ℃ 8 000×g離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定高鐵血紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、SOD活力。其中，MDA含量、SOD活力均以血紅蛋白計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽抗氧化肽的制備

2.1.1 辣木籽水解物的酶法制備與乙醇分級(jí)沉淀純化

表1 辣木籽水解物、乙醇分級(jí)沉淀組分和大孔樹(shù)脂柱層析組分的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗氧化活性Table 1 Protein contents and antioxidant activities of Moringa oleifera seed hydrolysate and fractions obtained by ethanol fractional precipitation and macroporous resin column chromatography

辣木籽水解物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.37%（表1），且呈現(xiàn)一定的抗氧化活性。因此，有必要以抗氧化活性為跟蹤指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行分離純化，定向制備出純度高、活性強(qiáng)的抗氧化肽。

乙醇通過(guò)特異性結(jié)合多肽，改變多肽結(jié)構(gòu)和相互作用性質(zhì)，沉淀多肽，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液與多肽的相互作用不同，從而將具有不同結(jié)構(gòu)特性的多肽進(jìn)行分離[17]。本研究首先采用乙醇分級(jí)沉淀法對(duì)辣木籽水解物進(jìn)行初級(jí)分離，得到5 個(gè)不同的乙醇分級(jí)沉淀組分（表1）。結(jié)果表明：各乙醇分級(jí)沉淀組分的抗氧化活性均高于辣木籽水解物，說(shuō)明辣木籽水解物中各組分存在拮抗作用，影響了其抗氧化活性的發(fā)揮。乙醇分級(jí)沉淀法可將各組分有效分離，提升辣木籽水解物的抗氧化活性。其中，60%醇沉組分蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且抗氧化活性較高，因此選取該組分進(jìn)行下一步分離純化。

2.1.2 大孔樹(shù)脂柱層析法分離純化

大孔樹(shù)脂具有安全性高、選擇性好、吸附速度快等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注和認(rèn)同[18-19]。本團(tuán)隊(duì)前期采用大孔樹(shù)脂柱層析法對(duì)醬油中呈鮮味肽進(jìn)行高效分離[20]，說(shuō)明其是一種高效分離純化多肽的方法。本研究采用XAD-16樹(shù)脂柱層析法分離60%醇沉組分，獲得4 個(gè)洗脫組分（表1）。結(jié)果表明：所得4 個(gè)洗脫組分抗氧化活性存在顯著差異，以60%乙醇洗脫組分蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（92.84%），抗氧化活性最強(qiáng)（DPPH自由基清除能力和ORAC分別為39.95、1 454.57 μmol/g，分別是辣木籽水解物的17.0 倍和8.5 倍）。說(shuō)明XAD-16樹(shù)脂柱層析法可對(duì)60%醇沉組分中抗氧化肽進(jìn)行有效分離，得到60%乙醇洗脫組分（下稱(chēng)辣木籽抗氧化肽）。

2.1.3 氨基酸組成分析

表2 辣木籽水解物和辣木籽抗氧化肽的氨基酸組成分析Table 2 Amino acid composition of Moringa oleifera seed hydrolysate and antioxidant peptide

多肽的抗氧化活性與其氨基酸組成密切相關(guān)，含有抗氧化氨基酸（Tyr、Cys、His、Met）、疏水性氨基酸（Leu、Ile、Pro、Phe等）的多肽能夠有效清除自由基[21-23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了辣木籽水解物和辣木籽抗氧化肽的氨基酸組成與質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表2）。結(jié)果表明：辣木籽水解物中，酸性氨基酸和疏水性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（共占總氨基酸的59.80%）。辣木籽抗氧化肽富含抗氧化氨基酸、疏水氨基酸（共占總氨基酸的54.37%），具有更強(qiáng)的抗氧化活性，說(shuō)明這兩類(lèi)氨基酸對(duì)辣木籽肽的抗氧化活性有重要貢獻(xiàn)。

2.2 基于生物可接受度評(píng)價(jià)辣木籽肽的抗氧化活性

生物可接受度是營(yíng)養(yǎng)物可被機(jī)體吸收利用的程度，指的是營(yíng)養(yǎng)物直接進(jìn)入人體的消化系統(tǒng)并可被人體胃、腸道溶解的部分，是評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)有效性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)[24-26]。

蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)入人體后，被胃、腸道中的多種酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和上皮細(xì)胞表面的肽酶）水解，所釋放的短肽被吸收并通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)靶器官[27-29]。因此，基于生物可接受度評(píng)價(jià)辣木籽肽的抗氧化活性，可為辣木籽肽作為高效抗氧化劑應(yīng)用于保健食品提供理論與方法指導(dǎo)。

2.2.1 模擬胃、腸道消化對(duì)辣木籽抗氧化肽ORAC的影響

圖1 模擬胃、腸道消化對(duì)辣木籽抗氧化肽ORAC的影響Fig. 1 Effect of simulated gastrointestinal digestion on ORAC of antioxidant peptide

如圖1所示，辣木籽抗氧化肽經(jīng)過(guò)胃、腸道消化后ORAC呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。說(shuō)明胃、腸道酶系可進(jìn)一步水解辣木籽抗氧化肽，生成抗氧化活性更強(qiáng)的片段。

2.2.2 UPLC-QTOF-MS/MS解析消化物中多肽組成與結(jié)構(gòu)

從辣木籽抗氧化肽消化物中共鑒定出11 條二肽和5 條三肽（表3）。其中含有抗氧化氨基酸的肽有5 條（Gln-His（QH）、Cys-Pro（CP）、Gln-Met（QM）、Gln-Arg（QR）、Gln-Met-Phe（QMF）），含有疏水性氨基酸的肽有9 條（Pro-Arg（PR）、Ala-Arg（AR）、Gly-Leu(Ile)（GL(I)）、Val-Glu（VE）、Leu(Ile)-Gln（L(I)Q）、Leu(Ile)-Phe（L(I)F）、Val-Leu(Ile)（VL(I)）、Ala-Leu(Ile)-Pro（AL(I)P）、Pro-Leu(Ile)-Gln（PL(I)Q）），既含有抗氧化氨基酸又含有疏水性氨基酸的肽有2 條（Ser-Ala-Cys（SAC）、Trp-Val-His（WVH））。由此可見(jiàn)，消化物中含有較多容易吸收[30]且具有潛在抗氧化活性的短肽。

表3 UPLC-QTOF-MS/MS分離鑒定辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物中多肽組成與結(jié)構(gòu)Table 3 Peptide pro filing of gastrointestinal digest of antioxidant peptide by UPLC-QTOF-MS/MS

2.2.3 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用

本研究對(duì)比了辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物、1 條含抗氧化氨基酸的二肽（Gln-Met）、1 條含疏水性氨基酸的二肽（Leu-Phe）和GSH對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用（圖2）。結(jié)果表明：經(jīng)AAPH損傷后，紅細(xì)胞發(fā)生溶血，溶血率為48.85%，與正常組（5.28%）相比具有顯著性差異（P＜0.05）（圖2a）。辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物、Gln-Met、Leu-Phe和GSH可顯著抑制AAPH損傷紅細(xì)胞發(fā)生溶血，且隨多肽質(zhì)量濃度增加溶血率顯著降低，4 種多肽對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用從強(qiáng)到弱依次是Gln-Met＝GSH＞辣木籽抗氧化肽＞Leu-Phe。

圖2 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用Fig. 2 Protective effect of gastrointestinal digest of antioxidant peptide on oxidatively damaged erythrocytes

AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可引起細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化，上調(diào)MDA含量（圖2b）。紅細(xì)胞經(jīng)AAPH損傷后，MDA含量為5.71 nmol/mg，是正常組（2.47 nmol/mg）的2.31 倍。4 種多肽可顯著下調(diào)氧化損傷紅細(xì)胞中MDA含量，且隨多肽質(zhì)量濃度增加胞內(nèi)MDA含量顯著下降，說(shuō)明4 種多肽可有效清除ROS，下調(diào)MDA含量。其中，Gln-Met在低、中、高3 個(gè)劑量下均可顯著降低胞內(nèi)MDA含量至正常組水平。

在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)比了4 種多肽對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞中SOD活力的影響（圖2c）。結(jié)果表明：模型組SOD活力顯著高于正常組，說(shuō)明ROS的過(guò)量產(chǎn)生激活了細(xì)胞中酶抗氧化防御系統(tǒng)，使得SOD活力升高[31-32]。4 種多肽可在一定程度上下調(diào)SOD活力，說(shuō)明這4 種多肽均能有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。少量ROS不足以激活酶抗氧化防御系統(tǒng)，因此，減少細(xì)胞中酶抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)AAPH所致氧化應(yīng)激的應(yīng)答可使SOD活力下降。

3 結(jié) 論

采用酶法制備辣木籽水解物，通過(guò)乙醇分級(jí)沉淀和大孔樹(shù)脂柱層析法定向制備辣木籽抗氧化肽，得到了高純度（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.84%）、富含抗氧化氨基酸（DPPH自由基清除能力、ORAC分別為39.95、1 454.57 μmol/g，分別為辣木籽水解物的17.0 倍和8.5 倍）、疏水性氨基酸的辣木籽抗氧化肽。

基于生物可接受度評(píng)價(jià)辣木籽肽的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，辣木籽抗氧化肽經(jīng)模擬胃、腸道消化后，抗氧化活性增強(qiáng)，釋放出更多短肽段，包括11 條二肽和5 條三肽。辣木籽抗氧化肽消化物、Gln-Met、Leu-Phe通過(guò)清除胞內(nèi)ROS，下調(diào)MDA含量與SOD活力，拮抗AAPH所致氧化應(yīng)激，有效抑制氧化損傷紅細(xì)胞發(fā)生溶血。辣木籽抗氧化肽具有很強(qiáng)的自由基清除能力，且生物利用度高，可以作為天然抗氧化劑用于保健食品。