燈盞乙素對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及機制

季宇彬，馬曉玉，陳榮昌，楊龍坡，孫桂波，孫曉波

(1. 哈爾濱商業(yè)大學藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2．中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100094)

近年來，缺血性心肌病的發(fā)病率不斷上升，嚴重威脅著人類的健康。隨著溶栓療法、心外科技術的不斷進步[1]，急性心肌梗死患者的死亡率已逐漸降低，然而，再灌注造成的損傷仍然給患者帶來嚴重的傷害。因此，心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)仍然受到廣泛的關注。燈盞乙素(scutellarin，Scu)是從菊科植物燈盞細辛中提取的黃酮類化合物，目前主要用于冠心病、心絞痛、中風、缺血性腦卒中等疾病的治療[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，Scu具有擴張血管、改善微循環(huán)、抗缺血損傷等作用[3]，但其對心臟保護的具體作用機制尚不明確。本實驗通過建立大鼠離體心臟心肌缺血/再灌注損傷模型，研究Scu對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠70只，♂，體質(zhì)量280～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物與試劑Scu標準品，購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒，均購自南京建成生物醫(yī)學工程研究所；白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-18、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、IL-6 ELISA試劑盒，均購于北京海泰通達科技有限公司；一抗β-actin、NF-κB、NLRP3、IL-1β，均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL化學發(fā)光顯色試劑盒、BCA試劑盒、細胞質(zhì)細胞核蛋白提取試劑盒，均購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 儀器ML870八通道生理記錄儀、PL3508B2-220Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易上海有限公司-PowerLab)；Minipuls 3型蠕動泵(吉爾森)；Infinite M1000酶標儀(瑞士Tecan公司)；電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1離體心臟Langendorff灌流模型的制備 SD大鼠經(jīng)20%烏拉坦(腹腔注射)麻醉后，舌下靜脈注射肝素鈉(25 mg·kg-1)行肝素化。迅速開胸，并取出心臟(保留足夠長的主動脈)，立即將動脈針套入主動脈并用縫合線扎緊，懸掛于Langendorff灌流裝置上，以恒溫(37.5 ℃)，充二元氧(95% O2+5% CO2混合氣體)，配制K-H，成分如下(g·L-1): NaCl 6.891 2、NaHCO32.09、KCl 0.350 15、KH2PO40.160 6、MgSO4·7H2O 0.290 8、CaCl20.283、葡萄糖1.998，pH 7.4。K-H液以恒流速12 mL·min-1持續(xù)逆流灌流15 min。待心臟活動穩(wěn)定后，通過八通道生理記錄儀記錄心肌收縮功能，包括左室內(nèi)壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)、心率(heart rate，HR)。離體心臟以K-H液灌流15 min平衡后，即可進行造模。本實驗采用全心缺血/再灌注損傷模型造模，即全心停灌30 min，再灌45 min，造成心肌缺血/再灌注損傷。

1.4.2Scu對心肌缺血/再灌注損傷的影響 SD大鼠70只，隨機分成5組(n=14)：空白組(Control)、模型組(I/R)、Scu高(HD)、中(MD)、低(LD)劑量組。Scu用生理鹽水配制為0.3、3、30 mg·kg-1，按10 mL·kg-1腹腔注射給藥，給藥組每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d，空白組和模型組同時給予等量生理鹽水。末次給藥60 min后，分離心臟，置于Langendorff離體灌流裝置上，空白組和模型組用K-H液灌流，Scu低、中、高劑量組用含Scu(0.3、3、30 mg·L-1)的K-H液灌流。在左心耳根部剪一小口，將球囊插入左心室(接ML870數(shù)據(jù)采集系統(tǒng))，實時記錄心肌收縮功能：LVSP、±dp/dtmax、HR。各組心臟平衡15 min后，模型組、Scu低、中、高劑量組行缺血/再灌注操作，造成心肌缺血/再灌注損傷?？瞻捉M心臟平衡后，持續(xù)灌流45 min。

1.4.3心肌組織HE染色 每組取6顆心臟，剪左心室，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，脫蠟后行HE染色，光鏡下觀察心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍色，每張切片在100倍光學顯微鏡下觀察，并隨機選取5個視野拍照。

1.4.4心肌組織生化指標檢測 每組取8顆心臟，選左心室同一部位組織，按1 ∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水進行勻漿，4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于生化指標檢測。按照試劑盒說明書，分別測定心肌組織LDH、CK、AST水平，ELISA法測定心肌組織炎性因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-18、IL-6水平。沉淀部分保存于-80 ℃，用于Western blot檢測。

1.4.5Western blot檢測心肌組織蛋白表達 心肌組織勻漿后，3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，加入組織裂解液重懸，于4 ℃裂解1 h ，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液即為總蛋白，細胞核蛋白提取按核蛋白抽提試劑盒操作說明進行。BCA法測定蛋白濃度，每組取20 μg的總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入NLRP3、NF-κB、IL-1β、β-actin、Lamin B一抗，4 ℃過夜；TBST溶液洗滌3次×5 min，加入辣根素過氧化酶標記的二抗，室溫孵育4 h，TBST溶液洗膜3次×5 min，ECL化學發(fā)光法顯影。

2 結果

2.1 Scu對離體大鼠心肌收縮功能的影響如Fig 1所示，與空白組比較，再灌注45 min時，模型組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，Scu中、高劑量組LVSP、+dp/dtmax、HR明顯升高，Scu低、中、高劑量組-dp/dtmax明顯升高(P<0.05)。表明Scu可以明顯改善缺血/再灌注心肌的收縮功能。

2.2 Scu對離體大鼠心肌組織AST、CK、LDH活性的影響如Tab 1所示，與空白組比較，模型組心肌組織中AST、CK、LDH活性明顯升高(P<0.05)，表明心肌組織發(fā)生損傷。與模型組比較，Scu劑量依賴性降低心肌組織LDH、CK、AST活性，其中Scu中、高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。表明Scu可以明顯改善離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷。

Tab 1 Effects of Scu on LDH, CK and AST release in myocardial tissue after I/R injury n=8)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model

2.3 Scu對離體大鼠心肌組織病理結構的影響如Fig 2所示，顯微鏡下觀察心肌組織，空白組心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，胞核清晰可見，細胞形態(tài)正常，心肌結構基本無異常。模型組心肌排列疏松、紊亂，有多處斷裂，間質(zhì)增寬伴隨水腫現(xiàn)象，心肌細胞核濃縮，可見多處變性壞死灶，程度較重，心肌纖維間可見大量炎細胞浸潤。與模型組相比，Scu中、高劑量組病變均有不同程度減輕。

2.4 Scu對離體大鼠心肌組織ICAM-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平的影響如Tab 2所示，與空白組比較，模型組大鼠心肌組織ICAM-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Scu可以劑量依賴性降低心肌組織各炎癥因子水平。其中Scu低、中、高劑量組ICAM-1、TNF-α降低差異具有顯著性(P<0.05)，Scu中、高劑量組IL-18、IL-6、IL-1β降低差異具有顯著性(P<0.05)。表明Scu對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用可能與抑制炎性因子的生成有關。

Fig 1 Effects of Suc on LVSP, +/-dp/dtmax and HR (1 mmHg=0.133 kPa) n=15)

Fig 2 Effect of Scu on isolatedmyocardial ischemia/reperfusioninjury in rats(HE,×200)

Tab 2 Effects of Scu on IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α and ICAM-1 release in myocardial tissue after I/R injury (ng·L-1, n=8)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model

2.5 Scu對心肌組織IL-1β、NLRP3蛋白表達的影響炎癥小體可以調(diào)節(jié)炎癥因子的生成與釋放，NLRP3是炎癥小體的重要組成蛋白，因此，本研究通過Western blot檢測心肌組織中NLRP3及下游IL-1β的水平。如Fig 3所示，與空白組比較，模型組IL-1β和NLRP3的蛋白含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，Scu各組明顯降低IL-1β表達水平(P<0.05)，Scu中、高劑量明顯降低心肌組織NLRP3蛋白表達(P<0.05)。表明Scu可能通過抑制NLRP3表達，進而抑制炎癥小體活化及炎性因子的生成。

2.6 Scu對心肌組織NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響NF-κB是體內(nèi)非常重要的炎性信號通路，Western blot結果顯示(Fig 4)，模型組細胞核內(nèi)NF-κB水平明顯升高(P<0.05)，而Scu可以劑量依賴性降低NF-κB的核轉(zhuǎn)位，Scu中、高劑量組差異具有顯著性(P<0.05)。以上研究結果提示，Scu抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。

Fig 3 Effect of Scu on protein expression of

1:Control；2:I/R；3:I/R+Scu LD；4:I/R+Scu MD；5:I/R+Scu HD.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model.

3 討論

近年來，缺血性心肌病的發(fā)病率不斷上升，嚴重威脅著人類的健康，其中缺血心肌恢復供血引起的MIRI越來越受到人們的關注。隨著藥物溶栓、冠脈搭橋術、瓣膜置換術、心臟移植等治療技術手段的提高和廣泛應用，探索防治MIRI的藥物已成為重要研究方向[4-5]。

Fig 4 Effect of Scu on protein expression of NF-кB in myocardial tissues n=8)

1:Control；2:I/R；3:I/R+Scu LD；4:I/R+Scu MD；5:I/R+Scu HD.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model.

LVSP、±dp/dtmax、HR是反映心功能的重要指標。LVSP是左心室收縮時產(chǎn)生的強大內(nèi)在壓力，其值反映左室的功能狀態(tài)。±dp/dtmax是左室內(nèi)壓最大下降速率和左室內(nèi)壓最大上升速率，其值反映心肌舒張功能。本研究顯示，Scu可明顯提高LVSP、±dp/dtmax、HR，改善左心室收縮與舒張功能。LDH、CK、AST是心肌損傷的標志物，當心肌組織發(fā)生病變時，LDH、CK、AST的含量明顯升高。研究顯示，Scu可明顯下調(diào)缺血/再灌注心肌組織中LDH、CK、AST的含量。結合心肌組織病理觀察，表明Scu可以減輕缺血/再灌注心肌組織的損傷，改善心肌收縮功能。

炎癥反應在MIRI過程中起到非常重要的作用。心肌缺血初期及再灌注過程中，均會激發(fā)心肌細胞內(nèi)源性的炎癥反應，誘導大量促炎因子的生成及釋放。炎性因子不僅引起心肌電生理重構和心律失常，還直接改變心肌細胞的生理狀態(tài)，誘發(fā)氧自由基的生成、細胞膜功能障礙和損傷，引起鈣超載，使心肌細胞嚴重受損，大量細胞凋亡、壞死、纖維化，進而導致心力衰竭而危及生命，抑制心肌炎癥反應對治療MIRI具有非常重要的意義[6]。多種炎性因子參與了MIRI，其中IL-1β是調(diào)節(jié)炎癥反應的關鍵因子，其參與了免疫細胞的募集，為其他促炎因子后續(xù)生成提供必要條件。基于IL-1β在炎癥反應中的重要作用，調(diào)控其生成可以明顯減輕MIRI。結果顯示，缺血/再灌注心肌組織炎癥因子水平明顯增加，而Scu能明顯下調(diào)缺血/再灌注心肌組織炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18、ICAM-1的水平。表明Scu對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用可能與抑制炎性因子的生成有關。

NLRP3炎癥小體的激活與MIRI的發(fā)生關系密切[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體NLRP3能夠通過激活炎性caspase-1蛋白激酶，誘導IL-1β的生成。缺血/再灌注心肌組織中，NLRP3及ASC蛋白表達水平明顯增加。炎癥小體的激活及IL-1β釋放最終導致細胞炎癥反應瀑布式發(fā)生，進而導致更多的內(nèi)源性危險信號的生成及炎癥信號的放大，引起中性粒細胞及單核細胞的黏附及自由基的生成，誘發(fā)細胞水腫、死亡，并損傷心肌成纖維細胞等[9]。炎癥小體及其下游炎性信號分子的激活是誘發(fā)心肌缺血后炎癥反應的重要途徑。抑制NLRP3炎癥小體的激活，對于減輕MIRI意義重大。本研究顯示，Scu可以明顯降低心肌組織NLRP3蛋白表達水平。

NF-κB信號通路廣泛存在于真核細胞中，靜息狀態(tài)下，NF-κB以一種無活性的形式在胞質(zhì)中，與抑制性蛋白IκB相結合；在刺激因素作用下，IκB磷酸化并降解，NF-κB由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，可促進下游炎癥基因轉(zhuǎn)錄的發(fā)生[10-11]，參與炎癥反應、細胞增殖、分化、凋亡等[12]。有研究表明，抑制NF-κB可下調(diào)NLRP3炎性小體的激活，進而減少IL-1β的分泌[1]。由于NF-κB是轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)發(fā)揮生理作用，因此，本研究通過Western blot檢測了其在細胞核內(nèi)的表達情況。研究結果顯示，相比于模型組，Scu可明顯降低NF-κB核轉(zhuǎn)位。

綜上，本研究證實Scu可明顯減輕再灌注過程中心肌組織的炎癥反應和損傷，提高心肌收縮功能，其作用機制可能與抑制NF-κB /NLRP3/IL-1β通路，進而抑制炎癥因子的生成有關。

(致謝：本實驗于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心實驗室完成，感謝所有參與實驗的老師及同學！)