結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞Tim-3、PD-1`表達及其臨床意義*

李曉咪 陸慧敏 李 歌 石通國 張光波 陳衛(wèi)昌&

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科1(215006)江蘇省(科教強衛(wèi))胃腸道腫瘤免疫重點實驗室2 江蘇省(高校)臨床免疫學(xué)重點實驗室3

背景：腫瘤的發(fā)生與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)，共刺激分子異常表達與執(zhí)行固有免疫功能的γδT細(xì)胞功能異常有關(guān)。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白分子-3(Tim-3)和程序性死亡分子-1(PD-1)是重要的負(fù)性共刺激分子，與相應(yīng)配體結(jié)合后可影響T淋巴細(xì)胞免疫功能，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。目的：初步探討結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達及其臨床意義。方法：選取2017年12月—2018年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院44例住院結(jié)腸癌患者，采集術(shù)前外周血標(biāo)本，40名健康志愿者作為對照組，以密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達，分析兩者表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細(xì)胞比例均顯著高于健康志愿者(P<0.05)，并與腫瘤體積和TNM分析呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達明顯升高并與腫瘤臨床病理分期相關(guān)，有可能成為評估結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的客觀指標(biāo)。

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、多種分子參與的過程，患者機體免疫狀態(tài)在其中發(fā)揮重要作用[1]。眾所周知，淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組分，T淋巴細(xì)胞根據(jù)T細(xì)胞受體(TCR)的組成差異，可分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞兩類。γδT細(xì)胞是一類進化上保守的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性固有T細(xì)胞，可快速識別外源性病原體和內(nèi)源性應(yīng)激誘導(dǎo)分子，并啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是機體免疫防御系統(tǒng)第一道防線的重要組成部分?；罨摩忙腡細(xì)胞在炎癥和腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮多種效應(yīng)功能，如釋放裂解酶以破壞細(xì)菌或損傷的細(xì)胞、分泌促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，或發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)等[2]。

T細(xì)胞的活化需有兩個信號：第一信號由TCR識別抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的抗原肽-MHC復(fù)合物(p-MHC)啟動；第二信號由T細(xì)胞與APC間共刺激分子的相互作用啟動。共刺激分子大致可分為正性共刺激分子和負(fù)性共刺激分子兩類，后者又稱為免疫檢查點(immune checkpoint)，包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、淋巴細(xì)胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin mucin-3, Tim-3)、程序性死亡分子-1(programmed death-1, PD-1)、B、T淋巴細(xì)胞衰減因子(B- and T-lymphocyte attenuator, BTLA)等。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Tim-3和PD-1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和外周血CD4+T細(xì)胞表面高表達，可能通過引起CD4+T細(xì)胞功能耗竭，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促進結(jié)直腸癌進展[3]。Tim-3和PD-1在結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞表面的表達情況是否與既往研究結(jié)果存在差異，目前尚未見文獻報道。本研究通過檢測結(jié)腸癌患者和健康志愿者外周血γδT細(xì)胞表面的Tim-3、PD-1表達，初步探討其表達變化在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。

材料與方法

一、臨床資料

2017年12月—2018年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科44例住院結(jié)腸癌患者納入研究，所有入組患者均為初診，入組前未接受過手術(shù)、放療、化療、生物治療等抗腫瘤治療，無全身性免疫系統(tǒng)疾病，術(shù)后病理證實為結(jié)腸癌；男性26例，女性18例，年齡37～93歲，平均(66.43±12.45)歲。另選取40名健康志愿者作為對照組，其中男性21例，女性19例，年齡30～75歲，平均(63.37±13.04)歲。病例組與對照組間性別、年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)實施(2018倫審批第046號)，標(biāo)本采集征得受檢者知情同意并簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；熒光抗體鼠抗人CD4-FITC、CD4-PE、CD3-PC5、CD3-PC7、γδT-FITC、IgG-PE、IgG-PC7、Tim-3-PE、PD-1-PC7(Biolegend公司)。CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。

三、方法

1. 標(biāo)本采集：結(jié)腸癌患者術(shù)前使用EDTA抗凝管采集空腹外周血標(biāo)本2 mL，以相同方法采集健康志愿者空腹外周血標(biāo)本2 mL，標(biāo)本于采集后2 h內(nèi)進行檢測。

2. 密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)：所采集的外周血標(biāo)本放入無菌離心管中，以無菌PBS稀釋血液1倍，反復(fù)吹打均勻后，加入預(yù)先加有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(稀釋血液與分離液之比為2∶1)，1 800 r/min離心25 min；吸取中間白色的淋巴細(xì)胞白膜層，加入預(yù)裝15 mL PBS的離心管中，1 800 r/min離心5 min；棄盡PBS，以15 mL PBS重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min。獲得的細(xì)胞即為PBMC，用于后續(xù)實驗。

3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例：取7只無菌流式管，分別加入PBMC (1～2)×106個(100 μL)，并依次標(biāo)記①～⑦，按相應(yīng)序號分別加入以下抗體：①空白對照組；②CD4-FITC 0.5 μL；③CD4-PE 0.5 μL；④CD3-PC5 0.5 μL；⑤CD3-PC7 0.5 μL；⑥CD3-PC5 0.5 μL +γδT-FITC 1.5 μL+IgG-PE 0.2 μL+IgG-PC7 0.2 μL；⑦ CD3-PC5 0.5 μL +γδT-FITC 1.5 μL+Tim-3-PE 3 μL +PD-1-PC7 3 μL。混合均勻后置于冰上避光孵育20 min，各管加1 mL PBS洗1遍，1 200 r/min 離心5 min；棄盡PBS，以300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo流式細(xì)胞分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細(xì)胞比例變化

流式細(xì)胞分析顯示，結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

二、結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細(xì)胞比例與臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計學(xué)分析顯示，結(jié)腸癌患者Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤體積和TNM分期呈顯著正相關(guān)，腫瘤體積越大、TNM分期越高，Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例越高(P<0.05)(表1)。

右半結(jié)腸：盲腸、升結(jié)腸、結(jié)腸肝曲、橫結(jié)腸；左半結(jié)腸：結(jié)腸脾曲、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸[4]

TNM分期：根據(jù)2017 NCCN結(jié)腸癌臨床實踐指南

腫瘤體積V=ab2/2(cm3)，a(cm)為腫瘤標(biāo)本最大直徑，b(cm)為腫瘤標(biāo)本最小直徑[5]

圖1 結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細(xì)胞比例變化

討 論

近年來，隨著生活習(xí)慣和膳食結(jié)構(gòu)的改變，在一些發(fā)展中國家，包括中國、俄羅斯、巴西等，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升[6]。結(jié)直腸癌發(fā)病機制復(fù)雜，機體免疫缺陷或免疫抑制是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一[1]。γδT細(xì)胞是執(zhí)行固有免疫功能的T細(xì)胞，其TCR由γ鏈和δ鏈組成，活化的γδT細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)、釋放顆粒酶和穿孔素以及通過Fas、TRAIL死亡受體途徑發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用[7]。目前研究表明，γδT細(xì)胞的活化和增殖需要CD28協(xié)同刺激信號，表明共刺激分子在γδT細(xì)胞的活化中起有重要作用[8]。

Gertner-Dardenne等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子BTLA與其配體皰疹病毒入侵介質(zhì)(HVEM)相互作用可負(fù)性調(diào)控γδT細(xì)胞分化和增殖，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。而與BTLA同為負(fù)性共刺激分子的Tim-3和PD-1在結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞中作用的研究尚少。Tim-3是T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域基因家族成員之一，PD-1為免疫球蛋白超家族成員，兩者在多種免疫細(xì)胞表面均有表達，如T細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DCs)、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)，可能參與機體炎癥和應(yīng)激反應(yīng)，同時其表達受腫瘤微環(huán)境中多種分子的調(diào)控。兩者與相應(yīng)配體結(jié)合后，T細(xì)胞出現(xiàn)“耗竭現(xiàn)象”，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫抑制功能增強，促使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage, TAM)向M2型極化，從而形成有利于腫瘤形成的微環(huán)境，進而促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[10-12]。

研究發(fā)現(xiàn)Tim-3、PD-1在多種惡性腫瘤的TILs和外周血中呈高表達，如結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌等，并與腫瘤進展和患者預(yù)后密切相關(guān)[3,10-11,13-14]；Tim-3基因多態(tài)性與包括消化系統(tǒng)惡性腫瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤風(fēng)險增加密切相關(guān)[15]。有學(xué)者分析了Tim-3在結(jié)腸癌組織和相應(yīng)正常結(jié)腸組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌組織中呈高表達，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后不良呈顯著正相關(guān)[16]。但Zhang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中的Tim-3表達顯著下調(diào)，并與腫瘤體積和TNM分期呈負(fù)相關(guān)，腫瘤體積越大、TNM分期越高，Tim-3 mRNA和蛋白表達水平越低。盡管有關(guān)Tim-3在結(jié)直腸癌中表達和功能的報道存在不一致性，但這些研究提示Tim-3在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，有待進一步深入研究。Berntsson等[18]的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中PD-1表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上述數(shù)據(jù)均提示Tim-3和PD-1與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。然而，目前關(guān)于兩者在結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞表面表達情況的研究尚少。本研究檢測了44例結(jié)腸癌患者和40名健康志愿者的外周血γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例均顯著高于健康志愿者，進一步分析其表達與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細(xì)胞比例與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與腫瘤體積和TNM分期顯著相關(guān)，腫瘤體積越大、TNM分期越高，即腫瘤負(fù)荷越大，外周血γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達水平越高。推測高表達的Tim-3和PD-1與相應(yīng)配體結(jié)合后，發(fā)揮對γδT細(xì)胞功能的抑制作用，使其失去免疫監(jiān)視、免疫清除能力，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)腸癌患者外周血γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達明顯升高并與腫瘤臨床病理分期相關(guān)，有可能成為評估結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的客觀指標(biāo)。本研究的不足之處在于樣本量偏小且未能對高表達的Tim-3和PD-1如何影響γδT細(xì)胞功能作進一步研究分析。后續(xù)研究擬擴大樣本量以驗證本次結(jié)果，并對Tim-3、PD-1影響γδT細(xì)胞功能的可能分子機制進行深入探討，從而更全面、充分地了解γδT細(xì)胞表面Tim-3、PD-1表達變化在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為結(jié)腸癌治療提供新的靶點。