EB病毒感染患兒免疫細胞功能變化及其臨床意義

劉雪凱 王迎時 辛勤 高雨菡

[摘要] 目的 研究兒童EB病毒（EBV）感染引起外周血淋巴細胞亞群及T淋巴細胞功能的變化，并探討血清EBV DNA載量與淋巴細胞亞群變化的關(guān)系。 方法 選取航天中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2015年1月～2018年7月收治的25例EBV感染患兒作為感染組;另選我院同期體檢的25名健康者作為對照組。采用流式細胞術(shù)檢測外周血中淋巴細胞亞群及CD8+ T淋巴細胞穿孔素和顆粒酶B的表達情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測外周血單個核細胞（PBMC）分泌γ干擾素（IFN-γ）和白細胞介素4（IL-4）水平。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（FQ-PCR）技術(shù)檢測血清EBV DNA載量。 結(jié)果 感染組外周血CD3+、CD8+細胞比值及絕對值明顯高于對照組（P < 0.001），CD4+細胞比值顯著低于對照組（P < 0.001），但兩組細胞絕對值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而感染組CD4/CD8比值顯著低于對照組（P < 0.001），但其比例變化與患兒血清EBV DNA載量不存在線性相關(guān)（r = 0.19，P > 0.05）。CD19+細胞比值及絕對值均低于對照組（P < 0.001）。兩組CD16+CD56+NK細胞比值及絕對值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與對照組比較，感染組PBMC的IFN-γ分泌增多（P < 0.01），IL-4分泌減少（P < 0.05）;CD8+ T細胞穿孔素和顆粒酶B分泌顯著增加（P < 0.05）。 結(jié)論 感染組外周血中淋巴細胞亞群及其功能有明顯變化，檢測其變化規(guī)律對了解患兒細胞免疫功能狀況及指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

[關(guān)鍵詞] EB病毒;淋巴細胞亞群;γ干擾素;白細胞介素4;穿孔素

[中圖分類號] R725.1;R440? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0072-05

EB病毒（EBV）為雙鏈DNA病毒，其感染多發(fā)生于兒童時期，可累及全身多個器官，與多種疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系，如傳染性單核細胞增多癥、淋巴瘤等[1-3]。EBV主要侵犯B淋巴細胞，并且能在感染后引起強烈的細胞免疫反應(yīng)，患者往往出現(xiàn)免疫細胞特別是淋巴細胞比例及多種細胞因子水平異常[4-6]。機體免疫水平及其對EBV的免疫應(yīng)答狀態(tài)與感染后不同臨床表現(xiàn)及疾病預(yù)后有密切關(guān)系。既往研究多關(guān)注于淋巴細胞亞群的改變，其對淋巴細胞功能的研究并不深入。

本研究通過檢測EBV感染兒童外周血淋巴細胞亞群及其功能變化以及其與EBV DNA載量的關(guān)系，以揭示EBV對兒童免疫功能的影響，深化對該病發(fā)病機制的認識，為臨床檢測及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取航天中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2015年1月～2018年7月收治的EBV感染兒童25例作為感染組。納入標準：①符合《兒童EB病毒相關(guān)疾病的診斷標準和治療原則》[7]的診斷標準;②EBV DNA>1×103拷貝/mL，患兒血清EBV衣殼抗原IgM檢測呈陽性;③患兒家屬自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并心肌炎、肝炎、溶血性貧血及血小板減少的危急病情;②入院前有相關(guān)免疫調(diào)節(jié)治療。感染組男14例，女11例;年齡1～12歲，平均（4.5±0.6）歲。另取我院同期體檢健康者25名為對照組，男15名，女10名;年齡1～12歲，平均（5.3±0.8）歲;體檢者近期均無感染及傳染病癥狀。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

BriCyte E6流式細胞儀及原裝配套抗體、溶血劑和質(zhì)控物（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）;ABI 7500實時熒光定量PCR分析儀（Thermo Fisher），相關(guān)檢測試劑（生產(chǎn)批號：p1101706004）購于天隆科技公司;抗體包括T淋巴細胞抗體試劑：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-perCP/CD4-APC;B淋巴細胞抗體試劑：CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC（批號：2017040100）、γ干擾素（IFN-γ）和白細胞介素4（IL-4） ELISA試劑盒購（生產(chǎn)批號：20141026）購自美國R&D公司;Anti-human perforin（生產(chǎn)批號：563762）、Anti-human granzyme B（生產(chǎn)批號：560211）、Anti-human CD8（生產(chǎn)批號：561952）、IC Fixation Buffer、10×Permeabilization Buffer（生產(chǎn)批號：554715）購于美國BD公司。

1.3 淋巴細胞亞群檢測

采用全血免洗法，即上機后流式細胞儀自動設(shè)門檢測CD3+T細胞、CD4+T細胞（CD3+CD4+）、CD8+T細胞（CD3+CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）和自然殺傷（NK）細胞（CD3-CD16+56+）占淋巴細胞總數(shù)的百分比及其絕對值，絕對值測量方法為體積法。CD3+/CD4+比值為計算值。

1.4 IFN-γ、IL-4檢測

采用密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，加入24孔板中，ConA（50 μg/mL）刺激48 h后收集上清，按照各自說明書檢測。

1.5 穿孔素及顆粒酶B的檢測

受試者外周肝素抗凝靜脈血裂解紅細胞后，加入Anti-human CD8避光染色30 min，洗滌離心，細胞加入固定劑和通透劑，洗滌離心，加入Anti-human perforin、Anti-human granzyme B避光染色30 min后上機檢測。

1.6 EBV DNA定量檢測

采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測EBV DNA的載量。EDTA抗凝全血3 mL，3000 r/min離心10 min，取50 μL血漿，加入50 μL核酸提取液，振蕩混勻15 s，干浴10 min后，以12.5 cm的離心半徑1500 r/min離心10 min，取上清液供實時熒光定量PCR使用。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血淋巴細胞亞群比值比較

感染組CD3+、CD8+細胞比例（CD3+：86.05±1.17;CD8+：65.52±1.88）明顯高于對照組（CD3+：68.08±1.85;CD8+：19.39±1.66），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001），且其CD4+、CD4/CD8比值（CD4+：14.35±0.96;CD4/CD8：0.23±0.02）顯著低于對照組（CD4+：43.35±1.28;CD4/CD8：2.43±0.23），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。感染組CD19+細胞比例（5.06±0.66）低于對照組（20.62±0.99），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。兩組CD16+CD56+NK細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（感染組：10.52±1.71;對照組：7.44±0.64，P > 0.05）。

2.2 兩組外周血淋巴細胞亞群絕對值比較

計數(shù)單位體積內(nèi)淋巴細胞數(shù)目（單位：個/μL），感染組CD3+、CD8+細胞數(shù)目（CD3+：13030±1518;CD8+：9910±1167）。明顯高于對照組（CD3+：3948±374;CD8+：1122±134），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。感染組CD19+細胞數(shù)目（595±74）低于對照組（1220±141），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。兩組間CD4+T淋巴細胞[CD4+T淋巴細胞：感染組（2057±247）、對照組（2525±265）]及CD16+CD56+NK細胞數(shù)目[CD16+CD56+NK細胞：感染組（1120±207）、對照組（653±132）]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 兩組CD4+T細胞功能比較

與對照組比較，感染組IFN-γ分泌顯著增加[感染組：（90.79±13.83）ng/mL;對照組：（57.05±8.72）ng/mL，P < 0.01]，而IL-4分泌減少[感染組：（63.94±18.67）ng/mL;對照組：（117.78±25.56）ng/mL，P < 0.05]。

2.4 兩組CD8+T細胞功能比較

與對照組比較，感染組CD8+T細胞穿孔素及顆粒酶B陽性細胞百分比均較對照組有顯著增加[CD8+T細胞穿孔素百分比：感染組（31.82±9.48）%、對照組（13.57±5.27）%，P < 0.01;顆粒酶B陽性細胞百分比：感染組（48.36±15.75）%、對照組（27.04±7.81）%，P< 0.05）]。

2.5 感染組CD4/CD8比值與EB DNA載量關(guān)系

感染組EBV DNA載量與淋巴細胞亞群CD4/CD8比值變化無相關(guān)性（r = 0.19，P > 0.05）。

3 討論

EBV感染患兒的臨床表現(xiàn)具有潛伏性，多樣性，可累及多個器官系統(tǒng)，并與一些惡性病變、腫瘤及自身免疫病等密切相關(guān)[8]。EBV的靶細胞是B淋巴細胞，病毒外膜蛋白gp350/P220與B淋巴細胞表面受體CD21結(jié)合后進入B淋巴細胞，不斷復(fù)制，繼而引起T淋巴細胞大量活化擴增[9-13]。本研究結(jié)果顯示，EBV感染患兒存在明顯的細胞免疫異常，主要表現(xiàn)在免疫細胞比例失衡與功能改變。與對照組比較，感染組CD19+ B細胞明顯減少，這主要是與靶細胞被大量殺傷有關(guān);CD3+ T細胞比例和數(shù)目增加，其中CD8+ T細胞的改變尤為顯著，提示機體細胞免疫激活，T淋巴細胞大量增殖，CD4/CD8比例明顯降低。感染組CD16+CD56+ NK細胞絕對值略有升高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），這可能與樣本量少有關(guān)。

Th1/Th2細胞亞群是CD4+ T淋巴細胞的兩種主要效應(yīng)細胞類型，其在細胞免疫發(fā)揮重要作用[14-16]。其中Th1細胞主要分泌細胞因子IFN-γ，介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，Th2細胞主要分泌細胞因子IL-4，促進變態(tài)反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，感染組外周血中PBMC的IFN-γ分泌增加而IL-4分泌減少，提示EBV感染后機體通過增加IFN-γ的分泌上調(diào)細胞免疫應(yīng)答，達到清除病毒的目的。CD8+ T細胞是殺傷靶細胞、參與細胞免疫應(yīng)答的主力效應(yīng)細胞，其識別靶細胞后可通過分泌穿孔素在靶細胞膜上打孔，導(dǎo)致細胞滲透壓改變，同時顆粒酶B進入細胞引起DNA裂解，細胞死亡[17-19]。本研究顯示，EBV感染后CD8+ T淋巴細胞被激活，上調(diào)穿孔素及顆粒酶B的表達，殺傷靶細胞，從而達到清除病毒的目的。

實時熒光定量PCR檢測EBV DNA是診斷EBV的金指標[20]。通過定量檢測機體EBV DNA拷貝數(shù)，反映EBV感染和病毒復(fù)制情況，并且EBV DNA載量與病情嚴重程度及預(yù)后密切相關(guān)[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，EBV感染后，機體CD4/CD8比例會減小甚至倒置，但并不能通過CD4/CD8比例變化程度推測體內(nèi)EBV DNA拷貝數(shù)的多少。

綜上所述，EBV感染患兒體內(nèi)淋巴細胞穩(wěn)態(tài)失衡，細胞免疫應(yīng)答功能增強。臨床對EBV感染兒童除采取積極抗感染措施外，還應(yīng)密切監(jiān)視患兒機體免疫情況，尤其是合并免疫功能低下及重癥患者，應(yīng)適當使用免疫調(diào)節(jié)劑，促進其機體細胞免疫應(yīng)答，加速機體對EBV的清除，促進患兒康復(fù)。

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（收稿日期：2018-11-26? 本文編輯：王? ?蕾）