雪峰蟲(chóng)草不同提取部位對(duì)誘導(dǎo)NB4 和U937細(xì)胞凋亡的影響

蔡 媛杜 青謝芳一張水寒

（湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙410006）

急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋcute lymphocytic leukemia，ALL）是一種進(jìn)行性造血系統(tǒng)惡性腫瘤，約占腫瘤發(fā)病率5%，且多發(fā)于兒童［1］。目前，對(duì)急性白血病的治療主要是化療、骨髓移植、靶向治療及細(xì)胞免疫治療、CAR?T 治療等，但其有損傷機(jī)體正氣、排異反應(yīng)、細(xì)胞因子風(fēng)暴等不良反應(yīng)［2］。因此，臨床迫切需求能夠扶正祛邪、殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物。臨床實(shí)踐證明中醫(yī)藥治療腫瘤有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，具有療效好、多靶點(diǎn)、低毒性等特點(diǎn)，從中藥中尋找高效、低毒、不產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤藥物是一個(gè)切實(shí)可行的途徑［3］。蟲(chóng)草類資源因其含核苷、多肽、萜類、多糖、甾醇等化合物，具有不同程度抗腫瘤活性，一直是腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)［4］，但因其稀缺，價(jià)格昂貴，在臨床上使用受限。雪峰蟲(chóng)草是線蟲(chóng)草菌科真菌雪峰蟲(chóng)草菌（Ophiocordyceps xuefengensis）寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座和幼蟲(chóng)尸體的干燥復(fù)合體，與冬蟲(chóng)夏草親緣關(guān)系極近［5］，是一種新的蟲(chóng)草資源，具有顯著的防癌治癌的效果。課題組前期發(fā)現(xiàn)雪峰蟲(chóng)草，對(duì)NB4 和U937細(xì)胞的IC50為3.76 和1.91μg／mL，根據(jù)《國(guó)家新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》 規(guī)定可判定其在體外對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用［6］，初步認(rèn)定雪峰蟲(chóng)草具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，但其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及具體的機(jī)制尚未明確。為了探究雪峰蟲(chóng)草物質(zhì)組成，明確其高效抗腫瘤活性物質(zhì)的分布，本實(shí)驗(yàn)以早幼粒白血病細(xì)胞NB4 和U937 為研究對(duì)象，采用不同極性溶劑對(duì)雪峰蟲(chóng)草進(jìn)行萃取后給藥干預(yù)，初探其主要藥效成分群，并分析其抗腫瘤可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 早幼粒白血病細(xì)胞株（NB4 和U937），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 雪峰蟲(chóng)草采于湖南省洞口縣雪峰山脈，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所生藥室劉浩副主任鑒定為雪峰蟲(chóng)草Ophiocordyceps xuefengensis。胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)42A0071K）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)8117165）；兔抗小鼠Cyt C 抗體（bs?4563R）、兔抗小鼠Bcl?2 抗體（10993?1?AP）、兔抗小鼠Bax 抗體（50599?2?lg）、兔抗小鼠caspase?9 抗體（10380?1?AP）均為美國(guó)proteintech 公司；FITC AnnexinⅤApoptosis Detection Kit 購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.3 儀器 IX71型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；超低溫冰箱（青島海爾電器國(guó)際股份有限公司）；三氣培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf 公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（美國(guó)Zealway 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；電泳儀、蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio?Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 將雪峰蟲(chóng)草烘干研末，稱定后置于2 000 mL圓底燒瓶，加入8 倍量蒸餾水回流提取2 次，每次2 h，濾過(guò)，收集濾液并冷凍干燥得到水提取物，1 g 提取物相當(dāng)于生藥122 g。殘?jiān)尤? 倍量75%乙醇回流提取2 次，每次2 h，濾過(guò)，收集濾液冷凍干燥得到醇提取物，1 g 提取物相當(dāng)于生藥126 g。取醇提取冷凍干燥粉用1.5倍體積乙酸乙酯連續(xù)萃取至乙酸乙酯層近無(wú)色，合并萃取液，冷凍干燥至粉末獲得乙酸乙酯提取物，1 g 提取物相當(dāng)于生藥138 g。精密稱定5 mg 不同提取物溶于25 μL DMSO，再定容至0.5 mL，超聲15 min，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，得到終質(zhì)量濃度10 倍的提取物母液（10 mg／mL），后續(xù)稀釋至所需質(zhì)量濃度進(jìn)行給藥干預(yù)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將NB4、U937細(xì)胞培養(yǎng)于含有DMEM 高糖培養(yǎng)基、10% FBS、1%雙抗和1%L?谷氨酰胺制成的培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4、U937細(xì)胞，離心，棄上清，用Binding Buuffer 重懸細(xì)胞，按照FITC Annexin Ⅴ／PI 凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入熒光染料PI 和FITC Annexin Ⅴ孵育后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。左下象限Q4 區(qū)代表活細(xì)胞（Annexin Ⅴ－／PI－），左上象限 Q1 區(qū)代表死亡細(xì)胞（Annexin Ⅴ－／PI＋），右下象限Q3 區(qū)代表早期凋亡細(xì)胞（Annexin Ⅴ＋／PI－），右上象限Q2 區(qū)代表晚期凋亡細(xì)胞（Annexin Ⅴ＋／PI＋）。

2.4 Western blot 法檢測(cè)NB4、U937細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4、U937細(xì)胞，并接種至96 孔板中，將兩種細(xì)胞均隨機(jī)分為正常組、DMSO組、水提取物組、乙酸乙酯提取物組和醇提取物組，合計(jì)10組。細(xì)胞靜置培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞懸液，1 200 r／min 離心5 min，重懸細(xì)胞，然后按分組詳情分別加入0.5% DMSO、1 mg／mL 水提取物、1 mg／mL 乙酸乙酯提取物、1 mg／mL 醇提取物，正常組則給予等量培養(yǎng)液。所有組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)干預(yù)作用24 h 后，收集細(xì)胞懸液，1 500 r／min 離心10 min，去上清，加入蛋白酶抑制劑PMSF 和RIPA細(xì)胞裂解液（1∶100）的蛋白質(zhì)抽提試劑，于冰上裂解2 h，12 000 r／min 離心10 min，取上清、分裝，－80 ℃保存、備用。采用BCA 試劑盒分別測(cè)定蛋白濃度，并根據(jù)各蛋白分子量大小選擇合適的電泳分離膠和濃縮膠。待蛋白樣本與上樣緩沖液混勻、變性后，進(jìn)行上樣處理，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗緩沖液，室溫振搖孵育1 h，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并通過(guò)蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并計(jì)算各蛋白的相對(duì)光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性且組間方差齊，則采用單因素方差分析；以Bonferroni 法進(jìn)行兩組間的比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4、U937細(xì)胞凋亡的影響與正常組比較，DMSO組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，說(shuō)明DMSO 溶劑對(duì)細(xì)胞的凋亡無(wú)影響，其余提取物組NB4、U937細(xì)胞凋亡率均增加（P＜0.05，P＜0.01）；相較水提取物組和醇提取物組，乙酸乙酯提取物組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用更為明顯。見(jiàn)圖1～2。

圖1 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4細(xì)胞凋亡率的影響（n＝3）

3.2 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4、U937細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 正常組與DMSO組無(wú)明顯差異，與正常組比較，水提取物組、乙酸乙酯提取物組和醇提取物組NB4、U937細(xì)胞內(nèi)Cyt C、Bax 和caspase?9 蛋白表達(dá)增加，Bcl?2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；相較水提取物組，乙酸乙酯提取物組NB4、U937細(xì)胞內(nèi)Cyt C、Bax 和caspase?9 蛋白表達(dá)增加，Bcl?2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1～2、圖3～4。

圖3 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4細(xì)胞凋亡蛋白的影響

表1 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

表1 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)NB4細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與水提取物組比較，＃P＜0.05；與醇提取物組比較，△P＜0.05。

表2 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)U937細(xì)胞凋亡蛋白的影響（， n＝3）

表2 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)U937細(xì)胞凋亡蛋白的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與水提取物組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖2 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)U937細(xì)胞凋亡率的影響（n＝3）

圖4 雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)U937細(xì)胞凋亡蛋白的影響

4 討論

我國(guó)蟲(chóng)草類藥用資源一直是抗腫瘤藥物研發(fā)熱點(diǎn)，蟲(chóng)草中含有核苷、多肽、生物堿、萜類、多糖、甾醇等化合物，具有良好的抗腫瘤活性［7?8］。有研究表明，冬蟲(chóng)夏草對(duì)肺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等，都顯示出不同程度的抑制作用，可與抗癌藥物聯(lián)用，共同發(fā)揮腫瘤抑制作用。但因蟲(chóng)草資源稀缺，市場(chǎng)價(jià)格昂貴，在臨床上尚未得到廣泛應(yīng)用。雪峰蟲(chóng)草作為第四次全國(guó)中藥資源普查發(fā)現(xiàn)的一種蟲(chóng)草新資源，具有生態(tài)適應(yīng)幅度廣，資源量大等優(yōu)勢(shì)，與冬蟲(chóng)夏草的親緣關(guān)系最近。經(jīng)主要功效成份與藥效學(xué)對(duì)比研究，具有相同的腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、氨基酸等化學(xué)成分及類似的功效，在洞口縣瑤族民間作為冬蟲(chóng)夏草代用品有近百年應(yīng)用歷史，效果顯著，是冬蟲(chóng)夏草最有前景的代用品。

目前，抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的最主要機(jī)制是影響信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即死亡受體途徑和線粒體途徑［9］。大量基因或相關(guān)蛋白以直接或間接的方式參與了凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)與調(diào)控。在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中，線粒體處于中心地位［10］，當(dāng)線粒體產(chǎn)生能量代謝障礙，線粒體膜完整性發(fā)生改變，能促使線粒體細(xì)胞色素C（Cyt C）釋放入胞質(zhì)中，與凋亡因子Apaf?1 結(jié)合并通過(guò)caspases 募集結(jié)構(gòu)域招募caspase?9 形成Cyt?C?Apaf?1?caspase?9 前體“凋亡體”，激發(fā)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11?12］。另外，凋亡因子Cyt C 的釋放源于線粒體外膜通透性的改變，其主要受到Bcl?2 蛋白家族的調(diào)控，其主要包括Bcl?2 亞家族蛋白中的抑凋亡蛋白Bcl?2 和Bax 亞家族的促凋亡蛋白Bax等，在線粒體途徑信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用［13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用雪峰蟲(chóng)草不同提取物作用于U937 和NB4細(xì)胞，通過(guò)FLC 檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)不同提取物對(duì)淋巴細(xì)胞具有不同程度的抑制，其中乙酸乙酯提取部位最為明顯。為了驗(yàn)證雪峰蟲(chóng)草提取物是否通過(guò)調(diào)控線粒體途徑通路誘導(dǎo)U937 和NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡，利用Western blot 實(shí)驗(yàn)對(duì)通路相關(guān)蛋白Bax、caspase?9、Cyt C、Bcl?2 表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雪峰蟲(chóng)草不同提取物均可以上調(diào)Bax、caspase?9、Cyt C 蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl?2 蛋白的表達(dá)，且乙酸乙酯部位和醇提部位效果最為顯著。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雪峰蟲(chóng)草的三個(gè)主要有效提取部位促進(jìn)體外U937 和NB4細(xì)胞凋亡和機(jī)制進(jìn)行了探討，綜上表明，雪峰蟲(chóng)草乙酸乙酯提取部位誘導(dǎo)U937 和NB4細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡效果最為明顯，可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白，特別是Bax 的表達(dá)有關(guān)。

初步探討了雪峰蟲(chóng)草不同提取物對(duì)急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞NB4 和U937 的促凋亡作用，并證明其誘導(dǎo)NB4 和U937細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡，初步闡明了雪峰蟲(chóng)草對(duì)急性淋巴白血病體外作用機(jī)理，為急性淋巴白血病的治療與新藥開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。下一步研究重點(diǎn)將對(duì)乙酸乙酯部位進(jìn)行藥效成分定性定量分析及藥效評(píng)價(jià)，為深入研究雪峰蟲(chóng)草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及建立其譜效關(guān)聯(lián)方法提供思路。