針刺足三里對(duì)苯妥英鈉在小鼠血漿及大腦皮質(zhì)藥物濃度的影響

楊曉婷 ，林 燊 ，葉麗宏 ，金 欽 ，齊詩(shī)儀 ，林 棟 （.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州350；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350）

苯妥英鈉是被廣泛用于癲癇發(fā)作的傳統(tǒng)抗癲癇藥物，臨床證明針?biāo)幝?lián)用可以產(chǎn)生更佳療效［1］。隨著藥動(dòng)學(xué)以及針刺機(jī)理研究深入，提示針?biāo)幝?lián)用可能通過影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布和代謝等過程，改變了血藥濃度、靶器官藥物濃度進(jìn)而產(chǎn)生協(xié)同作用［2］。故本實(shí)驗(yàn)旨在探究針刺效應(yīng)對(duì)小鼠血漿及大腦皮質(zhì)中苯妥英鈉濃度改變的影響途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只ICR小鼠均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心SPF級(jí)動(dòng)物室中進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲水進(jìn)食。

1.2 儀器與試藥 超高效液相色譜儀（型號(hào)：ACQUITY UPLC I-Class，美國(guó) Waters公司）；三重四極桿質(zhì)譜（型號(hào)：Xevo TQ-S，美國(guó) Waters公司）；十萬分之一分析天平（型號(hào)：CPA225D，德國(guó)Sartorius公司）；乙腈（德國(guó)Merck公司）、甲醇（德國(guó)Merck公司）均為色譜純；Mili-Q超純水（美國(guó)Milipore公司）；甲酸（上海阿拉丁試劑有限公司）為色譜純；苯妥英鈉（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.0%，批號(hào)：100210-201303）；延胡索乙素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度 99.0%，批號(hào)：110726-201718）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù) 18只ICR小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為針?biāo)?0 min組、藥針30 min組、藥物30 min組、針?biāo)?0 min組、藥針60 min組和藥物60 min組，每組各3只。各組干預(yù)措施：針?biāo)?0 min組及60 min組，針刺足三里后腹腔注射苯妥英鈉，注射后30 min組及60 min組取材；藥針30 min組及60 min組，腹腔注射苯妥英鈉后針刺足三里，針刺后10 min及40 min取材；藥物30 min及60 min組，腹腔注射苯妥英鈉，注射后30 min及60 min取材。取穴：足三里選穴參照李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，足三里位于小鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約0.5 cm處；針刺方式：采用0.25×13 mm一次性無菌針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：171258）針刺雙側(cè)足三里，進(jìn)針深度約1.5 mm，每5 min行一次平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法；給藥方式：腹腔注射苯妥英鈉0.5 mL／g。

2.2 樣品采集 所有動(dòng)物處理均按照2006年中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［3］的規(guī)定。血漿樣品采集：干預(yù)結(jié)束后，按壓小鼠眼周使眼球充血突出，用鑷子快速摘取小鼠眼球，并使血液從眼眶內(nèi)流入EP管中約1 mL，震蕩離心分離血清，-20℃冰箱中保存。大腦皮質(zhì)樣品采集：干預(yù)結(jié)束后，取出全腦，將全腦沿矢狀面切開，鈍性分離大腦皮質(zhì)，稱重后放入EP管，液氮中速凍，-20℃冰箱中保存。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取苯妥英鈉對(duì)照品9.95 mg至10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，備用（母液濃度為 0.995 mg／mL）。 精密吸取苯妥英鈉母液1 mL至50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋并定容，搖勻，為苯妥英鈉儲(chǔ)備液（濃度為19.9μg／mL）。精密稱取內(nèi)標(biāo)物延胡索乙素對(duì)照品8.40 mg至20 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，備用（母液濃度為0.42 mg／mL）。精密吸取延胡索乙素母液100μL至100 mL量瓶中，加入甲醇稀釋并定容，搖勻，為延胡索乙素儲(chǔ)備液（濃度為 420 ng／mL）。

2.4 供試品溶液制備 精密吸取融化至室溫的血漿樣品50μL，加入到5 mL的EP管中，先加入20 μL延胡索乙素儲(chǔ)備液，后加入乙腈至2 mL，渦旋1 min；取1 mL上述溶液，以14 000 r／min離心15 min除去蛋白；取上清液100μL，加入乙腈稀釋10倍，混勻，以 14 000 r／min離心 15 min，吸取上清液100μL于進(jìn)樣瓶，進(jìn)行液相質(zhì)譜測(cè)定。大腦皮質(zhì)樣品融化至室溫后，按 2 倍質(zhì)量體積比（mg∶μL＝1∶2）加入0.9%生理鹽水，進(jìn)行勻漿，渦旋混勻，制成0.5 g／mL的組織勻漿液；取100μL組織勻漿液，加入20μL的延胡索乙素儲(chǔ)備液，加入乙腈至2 mL，渦旋 1 min；取 1 mL上述溶液，以 14 000 r／min離心15 min除去蛋白；取上清液100μL，加入乙腈稀釋10倍，混勻，以 14 000 r／min離心 15 min，吸取上清液100μL于進(jìn)樣瓶，進(jìn)行液相質(zhì)譜測(cè)定。

2.5 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC@BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫（0.0～2.0 min，25%A→70%A；2.0～3.0 min，70%A→70%A；3.0～3.1 min，70%A→25%A；3.1～5.0 min，25%A→25%A）；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.25 mL／min；柱溫：45 ℃。

2.6 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；質(zhì)譜檢測(cè)器：三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器；檢測(cè)模式：正離子（ESI+）模式下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量模式。毛細(xì)管電壓 3 500 V；脫溶劑氣流（氮?dú)猓┝魉?800 L／h；脫溶劑溫度500℃；離子源溫度150℃；錐孔氣流（氮?dú)猓┝魉?50 L／h；碰撞氣體（氬氣）流速為 0.13 mL／min；苯妥英鈉保留時(shí)間：2.53 min；定量離子對(duì)：253.1→182；錐孔電壓：40V；碰撞能量：18V。延胡索乙素保留時(shí)間：1.79 min；定量離子對(duì)：356→192；錐孔電壓：40V；碰撞能量：28V。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到：

血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y＝0.368 6 X＋0.238 9（r＝0.998 5）

大腦皮質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y＝0.423 8 X－0.090 0（r＝0.998 6）

3.2 樣品測(cè)定按照“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.5”和“2.6”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各分析物的含量。結(jié)果見圖1。

圖1 血漿和大腦HPLC色譜圖

3.3 各組苯妥英鈉藥物濃度比較 見圖2。

圖2 各組苯妥英鈉藥物濃度比較

4 討 論

苯妥英鈉是傳統(tǒng)的抗癲癇乙內(nèi)酰脲類藥物之一，主要用于治療全身強(qiáng)直性痙攣性發(fā)作和部分性發(fā)作［4-6］等癥。苯妥英鈉血藥濃度與不良反應(yīng)呈正相關(guān)且半衰期延長(zhǎng)，同時(shí)治療窗狹窄，安全范圍小［7-9］，故苯妥英鈉容易發(fā)生蓄積和急性中毒并產(chǎn)生各種嚴(yán)重的不良反應(yīng)。彭俊平［10］用苯妥英鈉和丙戊酸鈉治療癲癇效果相近，但苯妥英鈉的不良反應(yīng)總發(fā)生率較高。苯妥英鈉因療效及經(jīng)濟(jì)原因尚應(yīng)用于臨床，在臨床中仍有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［11］。針?biāo)幝?lián)用可提高療效、縮短療程、減輕藥物毒副作用，作為一種重要的治療手段在臨床上得到推廣［12］。

本實(shí)驗(yàn)探討針刺足三里對(duì)于苯妥英鈉在小鼠血漿及大腦皮質(zhì)藥物濃度的影響。在相同給藥時(shí)長(zhǎng)30 min基礎(chǔ)上，增加針刺干預(yù)后苯妥英鈉血藥濃度明顯低于藥物30 min組。至苯妥英鈉給藥時(shí)長(zhǎng)60 min時(shí)，針刺組與藥物60 min組比較雖無顯著差異，但苯妥英鈉血藥濃度仍有偏低的趨勢(shì)；血藥濃度呈下降趨勢(shì)同時(shí)，各組大腦皮質(zhì)藥物濃度比較雖無顯著性差異，但針刺干預(yù)組別呈增加趨勢(shì)；針刺干預(yù)30 min組別血藥濃度顯著性降低的同時(shí)，大腦皮質(zhì)的濃度有提高的趨勢(shì)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是：針刺足三里促進(jìn)藥物分子通過血腦屏障，表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)藥物濃度的升高，但具體原因有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。苯妥英鈉在人體內(nèi)吸收呈雙峰值狀態(tài)，針刺足三里對(duì)于苯妥英鈉藥物濃度的影響方式仍需增加更多監(jiān)測(cè)時(shí)段證實(shí)。苯妥英鈉半衰期為7～22 h，經(jīng)肝代謝為“對(duì)羥基苯妥英鈉”，無生物活性，由腎臟排出。由于苯妥英鈉代謝飽和，當(dāng)血藥濃度逐漸增加時(shí)，半衰期逐漸延長(zhǎng)，易發(fā)生不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)表明針刺足三里可降低苯妥英鈉血藥濃度，但大腦皮質(zhì)濃度無明顯下降，其機(jī)制可能是加快靶向性藥物的體內(nèi)代謝過程，但具體代謝途徑需進(jìn)一步驗(yàn)證。