姜黃素中樞給藥對(duì)胰島素抵抗小鼠的改善作用及其機(jī)制研究

錢偉倫，高修濱，于志文，南麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體外周組織的胰島素敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮非常重要的作用，近年來已逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)［1］。中樞下丘腦氧化應(yīng)激會(huì)造成下丘腦的炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可以誘發(fā)外周整體胰島素抵抗和糖代謝紊亂［2-4］。中樞給藥可避過血腦屏障的影響，直接觀察藥物通過中樞對(duì)外周組織胰島素抵抗的影響。姜黃素是從姜科植物郁金塊根、姜黃根莖、莪術(shù)根莖以及天南星科植物菖蒲根莖等中提取出來的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化等生物學(xué)活性［5］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)胰島素抵抗具有較好的治療作用［6-8］。姜黃素能部分通過血腦屏障，不排除姜黃素外周給藥對(duì)中樞影響。姜黃素中樞給藥是否可以調(diào)控外周胰島素抵抗，目前報(bào)道較少，故本研究采用姜黃素中樞給藥觀察其對(duì)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠的作用，并探討其可能的作用機(jī)制，進(jìn)一步了解姜黃素改善胰島素抵抗的機(jī)制，為今后姜黃素治療糖尿病的臨床轉(zhuǎn)化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物和飼料 6周齡雄性SPF級(jí)C57BL／6J小鼠購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005］，飼養(yǎng)在福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0006］；低脂飼料（脂肪含量4.5%）、高脂飼料（脂肪含量60%）購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-002］。

1.2 試劑與耗材 胰島素（丹麥諾和諾德生物技術(shù)有限公司）；姜黃素（上海源葉生物科技有限公司）；DMSO（美國(guó) Sigma公司）；蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）、PKBSer473、 核糖體蛋白 S6 和 p-S6抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和內(nèi)參GAPDH抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；鼠二抗和兔二抗（美國(guó)Thermo Scientific公司）；硝酸纖維素膜（北京索萊寶科技有限公司）；ECL顯影液（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；血糖儀、血糖試紙（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；導(dǎo)管、導(dǎo)管帽（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；10μL微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）。

1.3 主要儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；小型垂電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽、基礎(chǔ)電泳儀電源和轉(zhuǎn)膜夾（美國(guó)Bio-Rad公司）；搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的配制 姜黃素20 mg加入0.543 mL的DMSO配制成100 mmol／L的姜黃素母液于-20℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將40μL姜黃素母液加入60μL的DMSO稀釋成最終濃度為40 mmol／L備用。

2.2 模型的制備和給藥方法 6周齡雄性SPF級(jí)C57BL／6小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為低脂組（LF 組，n＝8）和高脂組（n＝16），分別給予低脂飼料和高脂飼料飼養(yǎng)12周。飼養(yǎng)期間每周對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，12周后進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)定，若高脂組每只小鼠的體重達(dá)到40 g，葡萄糖耐量明顯高于低脂組小鼠（P＜0.05），提示模型復(fù)制成功。將造模成功的高脂組小鼠隨機(jī)分為高脂模型組（HF組，n＝8）和姜黃素組（Cur組，n＝8）。 各組小鼠均進(jìn)行側(cè)腦室埋管，埋管手術(shù)恢復(fù)2 h后，側(cè)腦室注射給藥連續(xù)3 d，1次／d。LF組和HF組側(cè)腦室注射生理鹽水 4μL，Cur組側(cè)腦室注射40 mmol／L姜黃素溶液 4μL。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 葡萄糖糖耐量的檢測(cè) 禁食不禁水12 h后，于次日早上每只小鼠腹腔注射葡萄糖 （1.8 g／kg），于腹腔注射后 0、15、30、60及 120 min剪小鼠尾尖取靜脈血，事先將血糖試紙插入血糖儀中，然后把血滴在血糖試紙指示孔上檢測(cè)血糖水平。

2.3.2 取材 末次給藥后，禁食不禁水12 h，待測(cè)完葡萄糖耐量后各組小鼠均腹腔注射胰島素（0.3 U／kg）。15 min后，斷頭處死小鼠，迅速取其肝臟組織置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，并迅速將其放入液氮中，待取材完畢后將所有樣品放入-80℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

2.3.3 肝臟蛋白提取 將裂解液提前解凍放置在冰上，取40 mg左右的肝臟組織，加入裂解液400 μL于組織研磨器中研磨，研磨至液體無組織碎片可視為勻漿完成；然后將組織勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，冰上放置30 min，期間每隔10 min震蕩 1次；30 min后在離心機(jī)中 4℃，14 000 r／min離心10 min；取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度；制成統(tǒng)一蛋白濃度為2μg／μL的蛋白樣品。

2.3.4 Western blot法檢測(cè) PEPCK、G6Pase蛋白的表達(dá)量和PKB、S6蛋白磷酸化水平 每孔上樣20 μL即上樣量為40μg進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)膜情況；用TBST洗去麗春紅，5%的脫脂牛奶封閉2 h；TBST洗膜 5 min，4次；將NC膜放置在 PKBSer 473、PKB、S6、p-S6、PEPCK 和 G6Pase（1∶1000）中，再放置于冰上，搖床搖晃過夜；回收一抗，洗膜4次，每次5 min；洗膜完后用5%BSA稀釋過的二抗（1∶5000）孵育 2 h；TBST 洗膜 4次，每次 5 min；用 ECL顯影液顯影。Image Lab圖像分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，以各組的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的相對(duì)比值表示各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 2組小鼠體重和血糖值比較 見圖1、圖2。高脂飼料喂養(yǎng)小鼠12周后，HF組與LF組比較體重明顯升高（P＜0.01），同時(shí)HF組糖耐量受到明顯損害，在 0、15、30、60 和 120 min 高脂組的血糖值均明顯高于LF組。

圖1 2組小鼠體重比較

圖2 2組小鼠血糖值比較

3.2 3組小鼠葡萄糖耐量血糖比較 見圖3。HF組血糖與LF組比較明顯升高（P＜0.01），Cur組與HF組比較顯著降低（P＜0.05）。

圖3 3組小鼠葡萄糖耐量血糖比較

3.3 3組小鼠肝組織中PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)量和PKB、S6蛋白磷酸化水平（PKBSer473、p-S6蛋白表達(dá)量）比較 見圖4、圖5。中樞給藥前HF組較LF組PKB和S6蛋白磷酸化水平明顯降低（P＜0.01），而HF組較LF組小鼠葡萄糖耐量和肝組織中PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。姜黃素中樞給藥3 d后，Cur組小鼠肝組織中PKB和S6蛋白磷酸化水平明顯高于HF組（P＜0.05），而肝組織中PEPCK和G6Pase蛋白表達(dá)量明顯低于HF 組（P＜0.05）。

3 討 論

圖4 3組小鼠肝組織中PKB、S6蛋白磷酸化水平比較

圖5 3組小鼠肝組織中PEPCK、G6pase表達(dá)比較

隨著現(xiàn)代人們生活水平的提高，高熱量食物的攝入和較少的體力運(yùn)動(dòng)消耗等，造成機(jī)體能量以脂肪形成的存儲(chǔ)從而造成異常和肥胖發(fā)病率的急劇升高，而肥胖與胰島素抵抗和2型糖尿病之間的聯(lián)系十分緊密［8］。本研究選用的高脂飼料喂養(yǎng)制備胰島素抵抗動(dòng)物模型的方法可靠性高、飼養(yǎng)方便且價(jià)格相對(duì)較低，目前被視為是胰島素抵抗動(dòng)物模型的常規(guī)制備方法之一［9］。

胰島素信號(hào)傳導(dǎo)及功能受損是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要因素［10］。在2型糖尿病患者中，肝臟的糖異生作用大大增強(qiáng)，這與胰島素抑制肝臟的內(nèi)源性葡萄糖生成的功能受到損害關(guān)系密切，其中糖異生作用的關(guān)鍵限速酶G6Pase和PEPCK是調(diào)控糖異生速度的核心作用點(diǎn)［11］。肝臟的胰島素信號(hào)通路能調(diào)控肝臟的糖異生，并可以調(diào)控PEPCK和G6Pase 的表達(dá)［12－13］。 有研究表明：在發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，胰島素信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子PKB和S6的磷酸化水平降低［14］，我們的研究顯示姜黃素中樞給藥可以降低PEPCK和G6Pase蛋白的表達(dá)，提高PKB和S6的磷酸化水平。

綜上所述，姜黃素中樞給藥后可明顯改善高脂模型小鼠的胰島素抵抗作用，其作用可能與增強(qiáng)肝臟胰島素信號(hào)通路相關(guān)因子PKB、S6蛋白磷酸化水平和抑制肝臟糖異生有關(guān)。