氮化碳納米片耦合適配體的赭曲霉毒素熒光檢測新方法研究

肖建平 ，許惠鳳 ，周 奕 ，張詩琪 ，王麗麗 ，葉蕻芝

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福建 福州350003）（2.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州350003）（3.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122）（4.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

中藥材是中醫(yī)發(fā)揮療效的主要物質基礎，中藥材安全問題是關系到服藥安全和療效保證的重要問題。然而中藥材在存放或者運輸時極易發(fā)生變質腐爛，產(chǎn)生以真菌毒素為主的致毒物質［1－2］。在現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素中，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）以毒性最大、平均產(chǎn)毒量最高、分布最廣泛、污染最嚴重被廣泛關注［3］，因此，對OTA含量的靈敏檢測具有重要的意義。

1 材料與儀器

1.1 主 要 試 劑 NaHCO3、Tris、KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2、HCl、甲醇等購自國藥集團（上海）化學試劑有限公司；OTA、赭曲霉毒素 B（ochratoxin B，OTB）、黃曲霉毒素B1（AFB1）等購自美國Sigma公司；1.24μM OTA標準儲備液用甲醇配制，4℃冰箱密封保存?zhèn)溆?；實驗所用化學藥品的純度均達到分析純級別；實驗用水均為Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化的超純水（電阻為18.2 MΩ）；實驗所用DNA序列為一端標記有羧基熒光素（FAM）的OTA適配體：5'-GATCGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-FAM-3'，該序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 主要儀器 透射電子顯微鏡（美國FEI公司，型號：TECNAI G2F20）；熒光分光光度計（美國 Varian公司，型號：Cary Eclipse）；紫外-可見分光光度計（日本島津公司，型號：UV1800）；管式爐（合肥科晶材料技術有限公司，型號：GSL 1400X）；酸度計（上海越平科學儀器有限公司，型號：PHS-3C）；微量高速離心機（美國 Thermo公司，型號：Micro17R）；恒溫金屬?。ê贾菝讱W儀器有限公司，型號：DKT-100）。

2 實驗方法

2.1 氮化碳納米片（g-C3N4nanosheets，CNNS）的合成制備 首先合成體相的g-C3N4：將3 g二氰胺放置在管式爐中，以約3℃／min的速率進行程序升溫并在600℃下加熱2 h，得到淡黃色的體相g-C3N4。接著制備 CNNS：100 mg的體相 g-C3N4粉末研磨后，分散在100 mL水中并超聲16 h；接著，將形成的混懸液以約6 000 rmp轉速離心5 min，除去殘留的未分散的g-C3N4；最后，收集上清液，并在60℃下在旋轉蒸發(fā)器中減壓濃縮，獲得牛奶狀懸濁液。CNNS懸濁液的質量濃度通過稱量一定體積懸浮液干燥后的CNNS質量來計算。

2.2 CNNS的形貌觀察 將所合成的CNNS懸濁液均勻滴加在超薄碳膜上，待干燥后在透射電子顯微鏡下放大至標尺為50 nm條件時觀察其表面形貌。

2.3 OTA適配體母液的制備 把1 OD的OTA適配體放入超高速離心機以10 000 rpm離心5 min，待取出后加入270μL的蒸餾水，充分混勻配成濃度為10μM母液；之后將該母液放入金屬恒溫加熱器中，在90℃下解鏈5 min；完畢后將該溶液取出，緩慢降至室溫，備用。

2.4 熒光光譜的測定 取2μL 10μM OTA適配體溶液與適量OTA（總體積 198μL）充分混合后37℃下反應 180 min，之后加入 2μL 100 μg／mL 的CNNS懸濁液振蕩混勻，靜置2 min后進行熒光檢測。熒光參數(shù)為：激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長掃描范圍500～650 nm，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫5 nm。

3 結 果

3.1 CNNS的形貌表征 從透射電鏡圖中可以看出，實驗所制備的CNNS為平面層狀且?guī)в旭薨櫟募{米片層，且?guī)缀跬该?，表明其具有超薄的片狀結構。見圖1。

圖1 CNNS的透射電鏡圖

3.2 CNNS含量對含有OTA和不含OTA溶液的熒光強度影響 分別往含有OTA和不含OTA溶液中加入不同濃度的CNNS，可以看出2組溶液的熒光強度均隨著CNNS用量的增加而降低，且不含OTA溶液的下降幅度明顯大于含有OTA溶液。當CNNS用量為1μg／mL時，2組溶液的熒光強度差異值達到最大。見圖2。

圖2 不同CNNS含量下的熒光強度對比圖

3.3 CNNS加入時長對含有OTA和不含OTA溶液的熒光強度影響 當1μg／mL CNNS加入到不含有OTA的適配體溶液后，該溶液的熒光信號迅速被淬滅。而當同濃度CNNS加入到含有OTA的適配體溶液后，其熒光強度降幅明顯變小，且在CNNS加入2 min后，該熒光強度與溶液中不含OTA時的強度差異值達到最高。見圖3。

圖3 不同CNNS加入時長的熒光強度對比圖

3.4 OTA與其適配體的反應時長對溶液的熒光強度影響 實驗考察了OTA與其適配體在不同反應時間下的熒光強度情況，從圖4可以看出，隨著目標物OTA與其適配體的作用時間延長，溶液的熒光強度也逐漸增強。當兩者反應時間達到180 min后，溶液的熒光強度達到最高。見圖4。

圖4 OTA和其適配體不同反應時間下的熒光強度對比圖

3.5 不同OTA濃度下的熒光光譜 在上述最佳實驗條件下，實驗進一步記錄了在不同OTA濃度下溶液的熒光光譜圖。從圖5中可以看出，溶液熒光強度隨著OTA濃度的增加而變大。見圖5。

圖5 不同OTA濃度下的熒光光譜圖

3.6 標準曲線的建立 實驗在上述熒光光譜結果的基礎上建立了OTA檢測的標準曲線，線性方程為：I／a.u.＝151.77 log COTA ／nM＋101.51（相關系數(shù) r＝0.991 9），線性范圍為 1～100 nM，檢測限為0.7 nM（S／N＝3）。 見圖 6。

圖6 OTA標準曲線

3.7 主要干擾物質的影響情況 實驗考察了OTB和AFB1在相同條件下的熒光信號響應。結果由熒光強度改變量來衡量，其定義為溶液在加入待測毒素之前和之后的熒光信號強度差值。結果顯示：OTA的存在會引起非常明顯的熒光信號改變，而10倍濃度的其它兩種毒素存在時溶液的熒光改變值并不明顯；另外，將三種毒素混合一起測定時，溶液熒光強度的改變和單純OTA的情況非常接近。見圖7。

圖7 不同毒素存在時溶液的熒光強度對比圖

4 討 論

我國現(xiàn)有的OTA檢驗方法主要有免疫親和層析凈化液相色譜法、離子交換固相萃取柱凈化高效液相色譜法、免疫親和層析凈化液相色譜-串聯(lián)質譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法和薄層色譜測定法等［4-7］。這些方法所用色譜、質譜等檢測儀器比較復雜、昂貴，局限于實驗室檢測，而快檢中的薄層色譜等方法的檢測靈敏度又相對低下，因此，很有必要進一步探索新的靈敏簡便的檢測方法。熒光分析法以靈敏度高、選擇性強和使用簡便受到廣泛的關注，目前已經(jīng)發(fā)展成為一種十分重要且有效的光譜化學分析手段［8］。本實驗結合熒光分析法的高靈敏度和核酸適配體的特異性識別能力來建立新的OTA檢測方法。

核酸適配體（aptamer）是一段由25～80個RNA或DNA堿基組成的寡核苷酸片段，它具有類似抗體的高特異性結合靶標分子的功能，且識別目標分子范圍更廣、更易于合成、穩(wěn)定性更佳等優(yōu)勢，目前已得到廣泛研究應用［9-10］。本實驗所采用的OTA適配體序列于2008年被Penner和Cruz-Aguado經(jīng)指數(shù)富集系統(tǒng)進化的體外篩選技術（SELEX）成功篩選得出，多個實驗證實其對OTA具有高度特異性結合能力［11-13］。而CNNS是近年來發(fā)展起來的納米層狀材料，由石墨型氮化碳經(jīng)過超聲剝離制得［14］，該材料擁有類石墨烯的理化性質，對單鏈DNA可通過強的π-π堆積作用將其吸附至表面，而對雙鏈DNA和其他DNA-分子復合物的吸附能力則大為下降［15］。也正基于此，在本實驗中，CNNS很容易將處于游離狀態(tài)的OTA適配體吸附到其表面，并通過光誘導電子轉移的模式［15］淬滅標記在適配體一端的熒光素基團。而當溶液中含有OTA時，該適配體與其靶分子OTA結合形成復合物，此時CNNS對該復合物的吸附能力大為下降，溶液的熒光信號得到恢復，且這種信號的變化情況與OTA的含量之間存在正相關。以上是本方法用于檢測OTA的基本原理。

從檢測靈敏度上看，該方法檢測限低至0.7 nM，具有較高的檢測靈敏度。這是因為該檢測模式為信號增強型，沒有目標物存在時整個體系的背景信號非常低，該情況下，目標分子引起的信號變化較信號抑制型（即初始信號100%，加入目標物后引起信號降低）的方法更為敏感。

從選擇性上看，真菌毒素的另外兩種主要成分OTB和AFB1在較高濃度下對OTA檢測的影響仍然十分有限，實驗表明該檢測方法對OTA的識別具有高選擇性，這一結果主要是由OTA適配體對其靶分子的高選擇性結合能力決定的。OTA適配體可以很容易地與低濃度的OTA結合形成復合物，但是與OTB和AFB1的結合能力相對弱化很多。當這兩種毒素存在時，該適配體仍主要以游離態(tài)存在而被吸附至CNNS表面，使溶液熒光處于低信號強度狀態(tài)，正因如此，該方法具有高度的檢測選擇性。

中藥材在生產(chǎn)、運輸和和存貯過程中容易發(fā)生霉變而產(chǎn)生OTA，本方法具有高度的檢測選擇性和良好的檢測靈敏度，有望用于對藥材復雜基質中的OTA的檢測。