黃體酮對成年斑馬魚下丘腦-垂體-性腺軸相關基因轉錄表達的干擾效應

梁燕秋, 董忠典, 黃國勇, 田斐, 李進, 應光國,*

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黃體酮對成年斑馬魚下丘腦-垂體-性腺軸相關基因轉錄表達的干擾效應

梁燕秋1,2, 董忠典1,*, 黃國勇2,3, 田斐4, 李進1, 應光國2,3,*

1. 廣東海洋大學, 湛江 524088 2. 中國科學院廣州地球化學研究所, 廣州 510640 3. 華南師范大學, 廣州 510631 4. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300

黃體酮(P4)是一種類固醇激素。為了探究P4的內(nèi)分泌干擾效應, 選擇成年斑馬魚()作為受試生物, 研究了P4對斑馬魚下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)相關基因轉錄表達影響。成年斑馬魚在不同濃度P4(2、11和16 ng·L–1)下處理21 d。結果顯示: 暴露于高濃度組的P4能夠抑制雌魚大腦中促性腺激素釋放激素2()、促性腺激素釋放激素3(), 卵泡刺激素()、雌激素受體1()基因的轉錄表達; 然而誘導了雄魚大腦中、黃體生成素()、雄激素受體()基因的轉錄表達, 這些轉錄變化暗示了P4對成年斑馬魚有潛在的弱雄激素效應。此外, P4暴露對雌魚卵巢和雄魚精巢類固醇合成途徑中固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白()、細胞色素p450介導側鏈裂解酶()、17α羥化酶()、卵巢細胞色素P450芳香化酶()、11β羥化酶()、羥基類固醇3β脫氫酶()、羥基類固醇20β脫氫酶()、羥基類固醇17β脫氫酶3()、羥基類固醇11β脫氫酶2()以及受體信號途徑中孕激素受體()、、基因的轉錄表達沒有顯著影響?？梢? 在P4暴露下, 斑馬魚大腦比性腺更加敏感。總而言之, P4能夠改變斑馬魚大腦中HPG軸相關基因的轉錄表達水平, 進而對斑馬魚的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有潛在的危險。

孕激素; 黃體酮; 內(nèi)分泌干擾; 基因轉錄表達

0 前言

近年來, 水環(huán)境中類固醇激素因其高的內(nèi)分泌干擾效應而得到了人們的廣泛關注。類固醇激素主要包括雌激素、雄激素、孕激素、鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素。過去, 人們主要關注了雌激素和雄激素的內(nèi)分泌干擾效應, 而對孕激素的的研究則很少。孕激素主要應用于人類口服避孕藥和激素替代療法中, 用于避孕和治療各種內(nèi)分泌疾病[1]。此外, 畜牧養(yǎng)殖業(yè)中也使用孕激素來提高動物生長速度以及控制母畜同期排卵和預防母畜流產(chǎn), 從而提高產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[2-4]。由于污水處理廠去除不徹底、動物的直接排泄和污水的直接排放, 導致了孕激素在污水處理廠出水、養(yǎng)殖場廢水和地表水等水環(huán)境介質(zhì)中都能檢出, 其濃度在幾個ng·L-1到幾萬ng·L-1不等[5-18]。其中, 黃體酮(P4)在地表水和城市污水處理廠出水中檢出濃度分別為199 ng·L-1和1 ng·L-1[11, 19]。此外, 在養(yǎng)豬場和奶牛場沖刷水中還檢出相當高濃度的P4, 濃度分別3470·ng·L-1和11900·ng·L-1[10, 12]。令人驚訝的是, P4在養(yǎng)豬場廢水排放河流中也能檢出, 濃度為30.5 ng·L-1[12]。環(huán)境中殘留的孕激素物質(zhì)(包括P4)將會對受納水體中的水生生物有潛在的風險。

目前已經(jīng)報道了許多孕激素物質(zhì)(如左炔諾孕酮、孕二烯酮、屈螺酮、去氧孕烯、炔諾酮、醋酸甲地孕酮和去氫孕酮)在非常低濃度時就會對魚類產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應, 抑制魚的生殖能力[20-24]。至于P4, 它的生殖毒性也有所研究[25-26], 然而關于其作用機制到目前為止還不清楚。

本研究選取斑馬魚作為受試生物, 從分子水平研究孕激素物質(zhì)P4低濃度暴露對斑馬魚成魚下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)相關基因轉錄表達的影響, 探討P4對斑馬魚的分子作用機制, 以進一步認識P4對斑馬魚的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的潛在風險。

1 材料與方法

1.1 化合物

P4(CAS 57-83-0)購買于Tokyo Chemical Industry公司(上海, 中國), P4溶于無水乙醇并配成濃度為1 mg·mL-1的母液, 置于–20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗魚類

健康3月齡成年斑馬魚()購買于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場, 然后轉入實驗室水族箱(45 L)馴養(yǎng)兩個月。飼養(yǎng)斑馬魚的水為曝氣2 d以上的自來水, 水的氧飽和度>80%, 水溫為26±1℃, 光暗周期比為14 h: 10 h, pH控制在7—8范圍內(nèi)。每天早上和下午分別投喂冰凍紅蟲(larvae)和豐年蝦()。馴養(yǎng)結束后進行實驗。

1.3 暴露實驗設計

選取10 L的玻璃缸作為暴露容器, 暴露溶液的體積為5 L。每缸放入健康的雌魚和雄魚各4條。斑馬魚成魚暴露于三個濃度梯度的P4(5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1), 同時設置溶劑對照組(含0.001%的乙醇)。所有P4暴露組均含有0.001%(v/v)乙醇助溶劑。每個處理組設置4個平行。實驗暴露周期為21 d, 暴露用水每天更新。實驗過程中水溫保持在(26±1)℃, 光暗周期為14 h:10 h。每天早上和下午分別投喂冰凍紅蟲和豐年蝦。在暴露期間, 每天記錄魚的死亡率、不正常的行為表現(xiàn)等。在暴露21 d后, 將所有魚置于冰上麻醉后馬上測量魚的全長(cm)和濕重(g), 以便計算生長狀況因子(condition factor,)。生長狀況因子計算公式為=(濕重/全長3)×100。測量結束后, 將魚解剖, 取出大腦和性腺組織(卵巢和精巢), 保存于RNAlater中, 用于分析HPG軸相關基因的轉錄水平。

1.4 基因轉錄水平分析

根據(jù)我們之前的研究方法[27], 利用Invitrogen公司的TRIzol試劑從斑馬魚大腦和性腺組織中提取總RNA, 然后通過瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測總RNA質(zhì)量, 使用美國Bio-Rad公司的SmartSpecTMPlus Spectrophotometer儀器測定RNA樣品在260 nm波長下的吸光值, 進而確定總RNA的濃度, 并根據(jù)A260/A280的比值來分析總RNA的純度。所有RNA樣品A260/A280的比值在1.8—2.0之間, 符合接下來實驗要求。根據(jù)Toyobo公司ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的指導方法, 將大約2 μg總RNA反轉錄成總體積為50 μL的cDNA。反應結束后, 加入150 μL的DEPC(焦碳酸二乙酯)水將合成cDNA稀釋到最終體積為200 μL, 并于-20℃下保存。

在ABI公司Applied Biosystems ViiATM7 Dx儀器上進行所有實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應。每個qRT-PCR反應體系的總體積為20 μL, 包括0.4 μL的上游引物(10 μM)、0.4 μL的下游引物(10 μM)、10 μL THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix試劑(Toyobo)、2.5 μL的cDNA樣品和6.7 μL的DEPC水。實時熒光定量PCR擴增按以下程序進行: 95 ℃× 1 min預變性后, 在95 ℃× 15 s, 60 ℃× 60 s進行40個循環(huán)。

我們之前的研究已經(jīng)報道了目標基因和內(nèi)參基因引物序列的詳細信息, 包括基因名稱、基因登錄號、核酸序列、擴增子大小等[28], 所有引物的擴增效率在96%—107%之間。選取了15個與HPG軸相關的基因, 檢測了雌魚和雄魚大腦中促性腺激素釋放激素2()、促性腺激素釋放激素3()、卵泡刺激素()黃體生成素()、孕激素受體()、雌激素受體1()和雄激素受體()基因的轉錄表達水平以及卵巢和精巢中固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白()、細胞色素p450介導側鏈裂解酶()、卵巢細胞色素P450芳香化酶()、11β羥化酶()、羥基類固醇3β脫氫酶()、羥基類固醇20β脫氫酶()、羥基類固醇17β脫氫酶3()、羥基類固醇11β脫氫酶2()、、和基因的轉錄表達水平。選取、和作為內(nèi)參基因是因為他們在溶劑對照組和處理組之間的穩(wěn)定表達。而且, 已經(jīng)報道使用多個內(nèi)參基因能夠更加準確地評價目的基因的轉錄水平[29]。所以, 本研究中采用、和這三個內(nèi)參基因的平均值對目標基因進行歸一化處理。按照Livak and Schmittgen[30]的2?ΔΔCt方法評估目標基因相對于參照因子(溶劑對照組的樣品)的相對表達量, 結果以log2的形式表示。

1.5 暴露水溶液中P4的測定

本實驗通過每天更新暴露水體以保持各暴露組P4的濃度穩(wěn)定。所有處理組的水樣只在暴露第14 d開始暴露時(0 h)和換水前(24 h)這兩個時間點收集。每個平行收集500 mL的水樣, 每個處理組有4個平行。每個時間點的第一個平行和第二個平行的水樣混合在一起作為第一個混合水樣品; 第三個平行和第四個平行的水樣混合在一起作為第二個混合水樣品。利用固相萃取柱(Oasis HLB, 6 mL, 500 mg)從水樣中提取目標化合物P4, 然后抽干固相萃取柱, 接著用10 mL的色譜純的乙酸乙酯洗脫固相萃取柱子。將洗脫液置于緩慢氣流氮氣中, 吹掉乙酸乙酯。用1 mL色譜純的甲醇重新溶解氮吹后玻璃管中的殘留物, 并上機檢測。目標化合物P4采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-MS/MS)(Agilent 1200 LC-Agilent 6460 QQQ, USA)進行分析測定[9]。P4在水樣中的檢出限和回收率分別為0.05 ng·L-1和92.4%—102%[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)值以平均數(shù)±標準差形式表示, 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析, 并用Origin 8.0進行作圖。數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性檢驗分別通過Kolmogorov-Simirnov和Levene’s tests進行驗證。采用單因素方差分析方法中的Tukey多重比較法對基因轉錄表達水平數(shù)據(jù)進行分析。當≤ 0.05(*),≤ 0.01(**)和≤ 0.001(***)時, 表示暴露組與溶劑對照組有顯著差異。

2 結果

2.1 暴露水體中P4的濃度

如圖表1所示, P4在T時刻的實測濃度比名義濃度低, 且在24 h后進一步降低了, 甚至在低濃度和中濃度暴露組中沒有檢測到。P4在三個暴露溶液的平均濃度分別為2 ng·L–1、11 ng·L–1和16 ng·L–1。另外, P4在溶劑對照組中沒有檢測到。所有暴露濃度數(shù)據(jù)都以它的實測濃度表示。

2.2 P4對斑馬魚成魚的存活和生長情況的影響

在暴露期間, 所有處理組都沒有發(fā)現(xiàn)死魚情況。P4沒有對斑馬魚的全長(total body length)、濕重(wet weight)和生長狀況因子(condition factor,)等產(chǎn)生顯著的影響(見表2)。

2.3 P4對斑馬魚成魚HPG軸相關基因轉錄水平的影響

2.3.1 P4對雌魚大腦中促性腺激素釋放激素基因和促性腺激素基因以及相關激素受體基因的轉錄表達影響

由圖1可知, 與溶劑對照組相比, 16 ng·L-1的P4可以使雌性斑馬魚大腦中和基因的轉錄表達量顯著降低, 但在低濃度和中濃度P4處理下沒有出現(xiàn)顯著性變化。相類似地, 11和16 ng·L-1的P4也顯著抑制了雌性斑馬魚大腦中和基因的轉錄表達。所有處理濃度的P4對雌性斑馬魚大腦中、和基因的轉錄表達沒有顯著影響。

表1 P4在暴露溶液中的名義濃度和實測濃度

注:a暴露時間 (0 h和24 h);b測定濃度為平均值±標準差。

2.3.2 P4對雌魚卵巢中類固醇合成途徑相關基因以及相關激素受體基因的轉錄表達影響

由圖2可知, 所有濃度處理組的P4對雌性斑馬魚卵巢中類固醇合成途徑(、、、、、、、和)和相關激素受體基因(、和)的轉錄表達沒有顯著影響。

2.3.3 P4對雄魚大腦中促性腺激素釋放激素基因和促性腺激素基因以及相關激素受體基因的轉錄表達影響

由圖3可知, 與溶劑對照組相比, 16 ng·L-1的P4顯著誘導了雄魚大腦中、和基因的轉錄表達水平, 而在2和11 ng·L-1的P4處理下則沒有出現(xiàn)顯著性的變化。然而, 所有濃度組的P4沒有顯著改變雄魚大腦中、、、和基因的轉錄表達。

2.3.4 P4對雄魚精巢中類固醇合成途徑相關基因以及相關受體基因的轉錄表達影響

由圖4可知, 所有濃度處理組的P4對雄性斑馬魚精巢中類固醇合成途徑(、、、、、、、和)和相關激素受體基因(、和)的轉錄表達沒有顯著影響。

表2 在不同濃度P4處理下21天后的斑馬魚成魚全長、濕重和生長狀況因子(K)的變化情況

注: 結果表現(xiàn)為平均值±標準差; n為4個平行樣品, 每個平行樣品中雌雄魚各4條。

注: 與溶劑對照組相比, 具有顯著性差異的組別用星號表示(*P≤ 0.05, ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001)。

Figure 1 Expression of,,,,,andmRNA in the brain of females in zebrafish after exposure to P4

圖2 P4對斑馬魚雌魚卵巢中star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、cyp11b、hsd3b、hsd20b、hsd17b3、hsd11b2、pgr、esr1和ar基因轉錄表達影響

Figure 2 Expression of,,,,,,,,,,andmRNA in the ovary of females in zebrafish after exposure to P4

3 討論

在斑馬魚成魚暴露實驗中, P4的實測濃度在開始暴露時(T)就出現(xiàn)了明顯的降低, 尤其是在高濃度暴露組降低了70%。由于T時刻的水樣是換完水后直接從魚缸中收集的, 所以P4的損失有可能是被斑馬魚個體消耗了, 或是被糞便中的微生物降解了, 進而說明了P4是比較不穩(wěn)定的。在24小時的暴露后, P4在低濃度和中濃度暴露組完全沒有檢出, 而在高濃度暴露組降低了90%。Blüthgen et al.[31]的研究也顯示了P4在斑馬魚成魚暴露實驗降低了90%。此外, 我們之前的研究報道了P4在斑馬魚幼魚暴露實驗中降低了50%[32], 而在斑馬魚早期胚胎暴露實驗中基本與名義濃度保持一致[33]。這些研究結果總體上說明了P4在成魚暴露實驗中要比胚胎和幼魚暴露實驗中很容易被水中微生物降解。Liu et al.[34]通過活性污泥中耗養(yǎng)生物降解菌實驗顯示P4的半衰期為4.3小時, 這進一步說明了P4很容易被微生物去除。

注: 與溶劑對照組相比, 具有顯著性差異的組別用星號表示(*P≤ 0.05, ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001)。

Figure 3 Expression of,,,,,andmRNA in the brain of males in zebrafish after exposure to P4

圖4 P4對斑馬魚雄魚精巢中star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、cyp11b、hsd3b、hsd20b、hsd17b3、hsd11b2、pgr、esr1和ar基因轉錄表達影響

Figure 4 Expression of,,,,,,,,,,andmRNA in the testis of males in zebrafish after exposure to P4

本文研究發(fā)現(xiàn)了P4能夠調(diào)節(jié)與HPG軸相關基因的轉錄水平。P4沒有顯著改變斑馬魚卵巢和精巢中的類固醇基因(、、、、、、、和)和受體基因(、和)的轉錄水平, 這與之前文獻報道的成魚暴露實驗結果是相一致的[35]。然而, 在我們之前的胚胎和幼魚暴露實驗中, P4能夠調(diào)節(jié)類固醇基因和受體基因的轉錄水平[33, 36]。這些基因在胚胎、幼魚和成魚階段的不同轉錄水平說明了它們是與時間相關的轉錄模式, 也是發(fā)育階段相關的轉錄模式, 這和之前文獻報道的另一種化合物是相一致的[37]。在雌魚大腦中, P4暴露降低了、、和基因的轉錄水平; 然而, 在雄魚大腦中, P4暴露提高了、和基因轉錄水平。這說明了P4對雌雄魚大腦基因的調(diào)節(jié)模式是相反的。P4主要是通過負反饋調(diào)節(jié)的方式來抑制、和基因的轉錄表達, 進而導致促性腺激素釋放激素(GNRH2和GNRH3)和促性腺激素(FSH)的合成和分泌, 最終抑制了雌魚大腦雌激素受體基因()的轉錄表達水平, 說明了P4有潛在的抗雌激素效應。然而, P4則是通過正反饋調(diào)節(jié)的方式來誘導和基因的轉錄水平, 進而促進了促性腺激素(FSH和LH)的合成和分泌, 最終提高了雄魚大腦雄激素受體基因()的轉錄水平, 說明了P4有潛在的雄激素效應。Hou et al.[38]顯示P4降低了食蚊魚肝臟中雌激素受體基因的轉錄水平, 而提高了雄激素受體的轉錄水平, 與本文的研究結果一致。此外, Hou et al.[38]還顯示了P4能夠引起雌性食蚊魚發(fā)生了輕微的雄性化效應, 進一步說明了P4具有弱雄激素效應。然而, 我們之前的研究報道了P4能誘導斑馬魚產(chǎn)生更多的雌魚, 但沒有改變和基因的轉錄表達水平[32], 與本文中P4的弱雄激素效應不一致。這說明了P4對斑馬魚幼魚的性別分化影響并不是通過激素受體來調(diào)節(jié), 具體調(diào)節(jié)機制有待以后的進一步研究。本研究中P4并沒有改變斑馬魚大腦和性腺中基因的轉錄水平, 與Zucchi et al.[35]的研究結果是一樣的。這可能是由于P4的活性要比魚體內(nèi)特有的孕激素(17α,20β-DHP)活性低造成的[39-40]?？偠灾? 對于P4暴露來說, 大腦比性腺更加敏感。

圖5總結了P4對斑馬魚全生命周期各個發(fā)育階段(胚胎、幼魚和成魚)的內(nèi)分泌干擾效應。P4對胚胎階段HPG軸相關基因轉錄水平的影響, 有可能影響幼魚性別分化以及干擾成魚的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng); 同樣地, P4對幼魚性別分化的影響, 也有可能干擾成魚的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。這些潛在的影響需要進一步的全生命周期暴露實驗(從胚胎開始暴露直到成年)來驗證。

圖5 P4對斑馬魚不同發(fā)育階段的內(nèi)分泌干擾效應。實線是P4暴露的3個實驗, 虛線是指3個實驗之間存在的潛在關系

Figure 5 Endocrine disrupting effects of P4 on the different stages of zebrafish. The solid lines designate P4 exposure each of the three studies depicted. The dashed lines represent possible linkages among the three studies

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The effects of progesterone on the mRNA expression of genes involved in hypothalamic-pituitary-gonadal axis in adult zebrafish

LIANG Yanqiu1, 2, DONG Zhongdian1*, HUANG Guoyong2, 3, TIAN Fei4, LI Jin1, YING Guangguo2, 3*

1. Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China 3. South China Normal University, Guangzhou 510631, China 4.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China

Progesterone (P4) is a steroid hormone. In order to reveal the endocrine disrupting effects of P4, the adult zebrafish () was exposed to 2, 11 and 16 ng·L-1P4 for 21 days, and the transcriptional expression profiles along the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis were determined. The results showed that the highest P4 exposure led to a significant down-regulation ofgonadotropin-releasing hormone 2 (), gonadotropin-releasing hormone 3 (), follicle stimulating hormone beta polypeptide () and estrogen receptor 1 () genes in the brains of females, and up-regulation of, luteinizing hormone beta polypeptide () and androgen receptor () genes in the brains of males. These transcriptional alterations implied that P4 could exhibit the potent weak androgenic activities in adult zebrafish. In addition, P4 exposure had no significant effects on the transcriptional profiles of target genes related to the steroidogenic pathways [steroidogenic acute regulatory protein (), cytochrome P450-mediated side-chain cleavage enzyme (), 17-alpha-hydroxylase (), ovarian cytochrome P450 aromatase (), 1-beta-hydroxylase (), hydroxysteroid 3-beta dehydrogenase (), hydroxysteroid 20-beta dehydrogenase (), hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase type 3 () and hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 ()] and hormone receptor genes [progesterone receptor (),and] in the ovaries of females and testes of males. Therefore, the brain was more sensitive to P4 exposure than the gonad in zebrafish. Taken together, the overall results demonstrated that P4 could significantly affect transcriptional expression levels of genes related to HPG axis in the brains, which may pose potential adverse effects to the endocrine system of zebrafish.

progestin; progesterone; endocrine disruption; gene transcription

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.02.001

X174

A

1008-8873(2019)02-001-08

2019-01-03;

2019-03-06

廣東省自然科學基金項目(2017A030310662, 2017A030313220, 2018A030307020); 國家自然科學基金項目(4180060608); 廣東海洋大學科研啟動費資助項目(R17075)

梁燕秋(1989—), 女, 廣東茂名人, 博士, 講師, 主要從事環(huán)境化學與生態(tài)毒理學, E-mail: liangyanqiu11@163.com

董忠典, 男, 博士, 講師, 主要從事水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖及分子生物學研究, E-mail: dzhd888@163.com

應光國, 男, 博士, 教授, 主要從事環(huán)境化學與生態(tài)毒理學研究, E-mail: guangguo.ying@gmail.com

梁燕秋, 董忠典, 黃國勇, 等. 黃體酮對成年斑馬魚下丘腦-垂體-性腺軸相關基因轉錄表達的干擾效應[J]. 生態(tài)科學, 2019, 38(2): 1-8.

LIANG Yanqiu, DONG Zhongdian, HUANG Guoyong, et al. The effects of progesterone on the mRNA expression of genes involved in hypothalamic-pituitary-gonadal axis in adult zebrafish[J]. Ecological Science, 2019, 38(2): 1-8.