金納米粒子用于小鼠乳腺癌光聲成像研究

祖蒞惠，代一猛，胡真真，韓亮，劉景鑫

1. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射線科，吉林 長春 130021；2. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春 130021

引言

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。目前乳腺癌的主要影像學(xué)檢查方法是鉬靶、超聲和MR[1]。上述檢查方法的應(yīng)用都存在一定的局限性，如鉬靶的假陽性率和假陰性率較高，超聲診斷依賴于操作者的診斷水平，MR檢查費用較高，且在乳腺癌診斷上的應(yīng)用價值也備受爭議[2]。因此急需一種診斷準(zhǔn)確、操作簡單、成本低廉的檢查技術(shù)手段。光聲成像（Photoacoustic imaging，PA）一種新興的成像模式，近來引起廣泛關(guān)注。它的成像原理是短波長幅度調(diào)制式或脈沖式激光脈照射生物組織后，部分光能被吸收轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽捎跓崦浝淇s效應(yīng)激發(fā)產(chǎn)生聲波[3]。PA成像將光學(xué)成像和超聲成像相結(jié)合，具有無侵襲性、易操作、高分辨率、高對比度等優(yōu)勢，是未來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的實時成像技術(shù)之一[4]。

在過去幾年里，金屬納米結(jié)構(gòu)（如Au、Cu和Pd）在催化、光子學(xué)及生物領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注，由此在生物傳感、藥物傳遞、腫瘤治療和分子成像等方面產(chǎn)生大量研究。Au納米星由于具有可調(diào)的等表面離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）吸收帶、較大的吸收-閃射比和摩爾消光系數(shù)，可能更適用于PA成像或光熱治療研究[5-6]。不同形態(tài)的金納米粒子（如殼、棒狀、星狀和納米籠）被用于光熱治療或PA成像研究。這些納米材料具有低光漂白、可調(diào)諧SPR特性、在近紅外區(qū)域強吸收、光熱轉(zhuǎn)換效率高等優(yōu)點[7]。其中，金納米殼在早期臨床研究中被用于頭、頸部和前列腺腫瘤的光熱治療。但是，金納米殼的合成過程較為復(fù)雜，金納米殼在一定時間內(nèi)很難排出體外，因此限制了其進一步應(yīng)用[8]。金納米棒不穩(wěn)定，在NIR光照射下容易融化[9]。金納米星的合成方法簡單，具有大吸收截面和高吸收散射比，被認(rèn)為是較為理想的PA成像材料[5-6]。

一般情況下，合成金納米材料需要使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）。CTAB具有很強的毒性，且很難用PEG置換[9]。本研究中我們使用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）對納米粒子行表面包覆。BSA是天然存在的蛋白質(zhì)，可用于還原和穩(wěn)定納米材料[10-11]；BSA含有豐富的官能團，如羧基、氨基和巰基，是較為理想的表面包覆劑。用其合成的納米粒子具有很好的生物相容性、膠體穩(wěn)定性，容易進行表面修飾，而且合成方法簡單[12-13]。

本研究中，我們將以一種綠色的金種子生長方法制備金納米星，選擇的表征策略包括TEM、DLS、FTIR、UV-vis-NIR吸收波譜等。細(xì)胞毒性實驗和不同組織病理切片用于評價其生物毒性。最后，本研究建立4T1乳腺癌模型，探索了給藥后腫瘤組織PA成像特點。

1 材料與方法

1.1 PA成像系統(tǒng)

Endra Nexus 128 PA斷層掃描系統(tǒng)（Endra Nexus128 PA Tomography System）用于成像。該系統(tǒng)配備了可調(diào)節(jié)的納秒脈沖激光器（20 Hz，7 ns脈沖，波長680～950 nm）；128個非聚焦超聲探頭（5 MHz中心頻率，3 mm直徑）排列成半球形，掃描時內(nèi)部盛滿38℃蒸餾水；一個碗狀中央含凸起的托盤置于其上方，用于固定成像部位，見圖1。Osirix（OsiriX Foundation, Genève，Switzerland）軟件（開放性軟件）用于數(shù)據(jù)處理和圖像重建。

圖1 PA成像系統(tǒng)示意圖

1.2 金納米粒子的制備

本研究采用綠色Au種子生長方法制備金納米星。Au種子合成：將過量檸檬酸鈉水溶液（3.5 mg，0.4 mL）和HAuCl4水溶液（0.25 mmol/L，9 mL）進行混合，置于磁力攪拌器上激烈攪拌。隨后，加入冰水預(yù)冷的NaBH4水溶液（0.33 mg，0.1 mL）。上述混合液在室溫條件下攪拌下2 h，得到Au種子溶液。

金納米星合成：將Au種子溶液（1.5 mL）、HAuCl4水溶液（45 mg，1.5 mL）、抗壞血酸溶液（50 mg，1 mL）和AgNO3溶液（5 mg，1 mL）混合，緩慢攪拌30 s后，加入BSA溶液（100 mg，10 mL）。室溫下攪拌12 h后離心分離（10,000 rpm，10 min），得到金納米粒子。

1.3 納米粒子的表征

我們選擇TEM觀測納米粒子的大小和形貌，DLS檢測粒徑分布，分光光度計檢測納米粒子的UV-vis-NIR吸收波譜。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性實驗

快速將凍存人肝癌細(xì)胞（HepG2）復(fù)蘇，復(fù)蘇后離心，去上清，加入含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在37℃和5% CO2條件下孵育。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，用5%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，加入96孔板（約5000個/孔），孵育過夜。隨后，吸出原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度納米材料的培養(yǎng)基 200 μL（0.065、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L）。對照組只含細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基。為排除納米粒子可能對吸光度產(chǎn)生的干擾，在細(xì)胞孵育24 h后輕輕吸走上清液，并用PBS溶液清洗三遍。每孔加入CCK8溶液10 μL，至溶液顏色變成深黃色后使用酶標(biāo)儀TECAN In finite? M1000PRO檢測吸光度值（波長450 nm），并計算細(xì)胞活性百分比。

1.5 體外PA信號檢測

本研究將激發(fā)波長設(shè)置在金納米星的SPR峰775 nm。選擇小分子PA成像對比劑亞甲藍(lán)作為參照（激發(fā)波長700 nm）。將裝有不同濃度金納米星和亞甲藍(lán)溶液的EP管于自制固定器上行掃描成像。于原始斷層圖像上勾畫ROI，記錄平均PA信號強度。勾畫ROI時盡量保證所選擇測量層面的位置相同、大小一致。

1.6 小鼠乳腺癌模型的建立

接種腫瘤前對小鼠背部皮膚脫毛。取對數(shù)生長期的4T1腫瘤細(xì)胞制成濃度為1×106個/mL的單細(xì)胞懸液，每只小鼠左上肢背部皮下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL。接種完成后，每天觀察接種部位變化情況，每周用游標(biāo)卡測量腫瘤長徑a、短徑b、高度c，根據(jù)公式：V=(a+b+c)π/s計算腫瘤近似體積。3周后，篩除瘤體過大、過小或者接種失敗的小鼠。4T1小鼠乳腺癌模型的成瘤率約為50%。選取6只瘤體大小相近，體積在0.8～1 cm3范圍內(nèi)的荷瘤鼠行成像掃描。

1.7 腫瘤PA成像

Endra Nexus 128 PA 斷層掃描系統(tǒng)（Endra，Michigan，USA）用于成像掃描。小鼠腹腔注射2%苯巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，取側(cè)臥位并固定瘤體于掃描中心處，設(shè)置激發(fā)波長為770 nm，重復(fù)時間為3 s。尾靜脈給藥200 μL（10 mmol/L），于給藥前、給藥后5 min、30 min、1 h、2 h行動態(tài)掃描。上傳數(shù)據(jù)到Osirix Lite系統(tǒng)，行3D MIP重建，半定量化測量腫瘤組織和腫瘤血管的PA信號強度。血管的ROI選取在直徑最大的管徑處。瘤體的ROI勾畫盡量包括整個腫瘤組織，但要盡量避開大血管。不同時間上ROI大小、位置保持基本一致，記錄ROI內(nèi)平均PA信號強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件, 實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用t檢驗法進行比較。

2 結(jié)果

2.1 金納米粒子的表征

TEM下見納米粒子呈不規(guī)則星狀結(jié)構(gòu)，表面見不規(guī)則毛刺、凸起，大小分布較為均勻（圖2a）。DLS測得平均粒徑為86 nm，約95%集中分布在43～91 nm之間，如圖2b所示。通過對納米粒子的吸光度進行檢測，發(fā)現(xiàn)金納米星的SPR峰位于775 nm，處于近紅外（650～900 nm）區(qū)域。

圖2 納米粒子TEM圖（a）和粒徑分布（b）

良好的生物相容性是納米材料活體應(yīng)用的前提。本研究中我們選擇細(xì)胞毒性試驗評價其體外生物毒性。結(jié)果顯示，最高給藥濃度條件下（1 mmol/L）的細(xì)胞活性百分比為94%（圖3b），未見明顯生物毒性。

圖3 納米粒子的UV-vis-NIR吸收波譜（a）和MTT實驗（b）

2.2 乳腺癌PA成像研究

給藥前腫瘤組織PA成像可見腹壁血管顯影（圖4）。給藥后血管信號增強，成像范圍變大，且2 h內(nèi)未見明顯變化（圖5）。此外，腫瘤組織呈明顯不均勻強化，腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管可見。1 h后，PA信號強度達(dá)到最大，直至2 h后未見明顯變化（圖6）。

3 討論

隨著納米醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，大量新型納米材料被用于疾病診療研究[14-15]。PA成像一種新興的成像模式，近來引起人們關(guān)注，其在成像分辨率上具有顯著優(yōu)勢。PA成像基于生物組織內(nèi)部光學(xué)吸收的差異性，以超聲為媒介的一種生物光子成像方法。PA成像過程包括光學(xué)激發(fā)、超聲探測及圖像生成。持續(xù)短激發(fā)脈沖可以使生物組織產(chǎn)生聲波。聲波強度，即PA信號強度受光源、組織的熱學(xué)、光學(xué)和機械特性等影響。PA成像的激發(fā)波可以從紫外波段到紅外波段。由于散射或非閃射光都可以產(chǎn)生PA信號，因此深層組織內(nèi)也可以產(chǎn)生PA信號。PA成像組織的穿透深度在厘米范圍，空間分辨率可達(dá)微米級別。PA成像可以實現(xiàn)細(xì)胞器、細(xì)胞、組織再到器官的多維度成像，進而提供結(jié)構(gòu)、功能和分子信息。

圖4 荷瘤鼠PA圖像

圖5 給藥前和給藥后不同時間點上腹壁血管PA信號強度

圖6 給藥前和給藥后不同時間點上腫瘤組織PA信號強度

外源性造影劑的研發(fā)使PA成像的應(yīng)用擴展到分子成像和基因成像，包括有機染料、報告基因和納米粒子等。為探索PA成像腫瘤的可行性及其成像特點，本研究構(gòu)建合成金納米星。不同形態(tài)的金納米粒子可作為PA造影劑使用，通過將SPR調(diào)整到近紅外區(qū)，可以減少內(nèi)源性造影劑的光吸收，并提高成像深度。目前，用于PA成像納米材料的主要問題是合成流程較復(fù)查，可重復(fù)性較差，部分納米材料具有毒副作用。目前我們少見將單純金納米材料用于PA成像研究。在構(gòu)建納米材料的過程中，為降低納米粒子的生物毒性，提高生物相容性，通常需要在其表面行配體交換或者用兩親聚合物或者脂類表面包覆。常用的聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）包覆過程較為復(fù)查，殘留的CTAB有一定的生物毒性，且PEG不可生物降解，較難和配體相結(jié)合[16]。本研究采用金種子生長方法，以BSA為模板，來構(gòu)建金納米星。BSA是天然存在的多肽聚合物，具有高生物相容性、生理條件下高穩(wěn)定性、低免疫原性、可降解性和存在可修飾的官能團等諸多特點[17-18]。

本研究中金納米星的平均粒徑為86 nm，且大部分粒徑在100 nm以下。以往的研究表明，粒徑在1～100 nm的納米材料相對于其他尺寸更適用于活體成像或疾病診療等方面應(yīng)用[19]。金納米星的SPR峰位于775 nm附近，處于近紅外光區(qū)（650～900 nm）。氧化血紅蛋白、還原血紅蛋白和水對近紅外光的吸收能力相對較差，因此SPR位于NIR區(qū)可以提高成像的組織穿透深度和信號噪聲比，更只用于生物組織成像。細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明納米粒子具有很好的生物相容性。同PEG包覆相比，BSA包覆的納米材料可能更適用于活體成像應(yīng)用[9,20]。

生物組織內(nèi)有很多內(nèi)源性PA對比劑，如DNA/RNA、血紅蛋白和黑色素。為可視、辨別腫瘤組織和正常組織，通常需要外源性PA對比劑。為探索金納米星腫瘤對比增強效果，經(jīng)尾靜脈給藥后（10 mmol/L，200 μL）不同時間點進行腫瘤成像掃描。從3D MIP圖和PA信號強度檢測結(jié)果中可以看出，金納米星可以提供很好的PA對比增強效果和居于較長的血液循環(huán)時間。血紅蛋白是活體內(nèi)天然存在的PA對比劑，因此在給藥前成像組織血管可見。給藥1 h腫瘤組織的PA信號強度接近最大，約為給藥前的3倍，說明金納米星具有良好的增強滲透保留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應(yīng)。EPR效應(yīng)是因為腫瘤組織血管密度較高且血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)不完整，加上淋巴系統(tǒng)受損，納米粒子在腫瘤組織長時間高濃度聚集的現(xiàn)象[21]。EPR效應(yīng)有助于腫瘤顯像，提高腫瘤診斷的靈敏性，是腫瘤靶向成像和治療的基礎(chǔ)。此外，由于具有光聲效應(yīng)的納米材料，同時也具有光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)，本研究中納米粒子也適用于腫瘤光熱治療。雖然PA在成像靈敏性和分辨率方面具有一定的優(yōu)勢，但由于組織穿透深度限制，目前的PA成像研究也多選擇乳腺癌作為靶向研究對象[4,22]。在本部分研究結(jié)果表明金納米星適用于進一步腫瘤靶向成像、治療探針的研發(fā)，這為我們未來的腫瘤靶向成像與治療工作的進行打下良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

總之，我們證實了一種的新型的可用于PA成像的金納米粒子對比劑。本研究中應(yīng)用的合成方法簡單、可重復(fù)性好。金納米星展現(xiàn)出良好的生物相容性、光聲轉(zhuǎn)化效應(yīng)，有望為腫瘤靶向PA成像及光熱治療提供新的研究方向。此外PA成像容易操作、可重復(fù)性好、成本低、高分辨率成像、高靈敏性，具有巨大的臨床應(yīng)用潛能。