瀉肺定喘湯對(duì)中性粒細(xì)胞型哮喘大鼠KLF-2/RelA比例平衡及中性粒細(xì)胞凋亡的影響*

韓 瑩 蔡慶宇 張 巖

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省佳木斯市中醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的，以可變性呼氣氣流受限、氣道高反應(yīng)和氣道重塑為特征的呼吸道炎癥性疾病［1］。根據(jù)最新的一項(xiàng)調(diào)查顯示，哮喘的總發(fā)病率為6.79%，其中以0～15歲及55～64歲的人群發(fā)病率最高，分別為13.05%和10.56%，且女性顯著高于男性［2］。而且隨著近年來(lái)環(huán)境污染的加劇和生活方式的改變，本病的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

2009年全球哮喘防治創(chuàng)議首次提出 “表型”的概念，通過(guò)疾病表型的分類，能夠更好地指導(dǎo)哮喘的治療和預(yù)后的判斷。過(guò)去的研究認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞（EA）是哮喘氣道炎癥反應(yīng)的主要原因，但是越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%的哮喘是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主［3］。與EA 相比，中性粒細(xì)胞型哮喘（NA）的臨床表現(xiàn)及肺功能更差，急性發(fā)作的次數(shù)更多，而且缺乏有效的治療措施［4］。因此，本研究通過(guò)采用瀉肺定喘湯進(jìn)行干預(yù)NA模型，并觀察KLF-2/RelA比例的平衡及中性粒細(xì)胞的凋亡，以明確瀉肺定喘湯的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量（213±12）g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［動(dòng)物合格證批號(hào)：SCXK（黑）2015-003］。 購(gòu)入后置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件2級(jí)，溫度18～27℃，相對(duì)濕度45%～75%，自由飲水，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 藥劑和儀器 瀉肺定喘湯由白果15 g，麻黃10 g，桑白皮 10 g，地骨皮 10 g，款冬花 10 g，黃芩 10 g，紫蘇子10 g，法半夏5 g，杏仁5 g，炙甘草5 g組成，購(gòu)于佳木斯市中醫(yī)院中草藥局。藥物置于冷水中浸泡2 h后煎煮至生藥質(zhì)量濃度為低（0.5 g/mL）、中（1 g/mL）和高（2 g/mL）的藥汁。 脂多糖（LPS）、10%卵白蛋白（OVA）、Percoll分離液均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；瑞氏染色試劑盒購(gòu)于上海君瑞生物技術(shù)有限公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，兔抗大鼠 KLF-2、RelA（p65）、促凋亡基因（Bax）和抑制凋亡基因（Bcl-2）多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；兔抗大鼠β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司；超聲霧化器購(gòu)于上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司；電泳儀、電泳槽和凝膠成像分析系統(tǒng)均購(gòu)于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 大鼠隨機(jī)分為空白組（Control）、模型組（NA）、地塞米松組（DXN）、瀉肺定喘湯低劑量組（XFD Low）、瀉肺定喘湯中劑量組（XFD Medium）和瀉肺定喘湯高劑量組（XFD High），每組8只。除空白組外，余組大鼠均按照文獻(xiàn)中方法復(fù)制NA模型［5-6］，具體方法如下：于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第0天、第7天和第14天腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后，LPS鼻腔滴入（0.1 μg）和 OVA 腹腔注射（100 μg）聯(lián)合致敏，從第 15天開(kāi)始給予OVA（10 g/L）霧化吸入激發(fā)，每日1次，每次30 min，連續(xù)2周。空白組大鼠給予生理鹽水替代LPS和OVA致敏和激發(fā)。

1.4 給藥方法 各藥物干預(yù)組于第15天開(kāi)始，在每次霧化吸入激發(fā)前30 min給予相應(yīng)的藥物治療。其中地塞米松組給予地塞米松混懸液0.75 mg/kg灌胃，中藥治療藥量參照體表面積法計(jì)算［7］，瀉肺定喘湯各劑量組分別給予0.5 g/kg、1 g/kg和2 g/kg的瀉肺定喘湯灌胃治療，而空白組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，上述灌胃治療每日1次，連續(xù)2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）肺泡灌洗液的采集：于末次霧化激發(fā)24 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用磷酸緩沖溶液（PBS）灌洗肺泡，按照文獻(xiàn)中方法［8］收集支氣管肺泡灌洗液，1 500 r/min離心后，回收離心后的細(xì)胞沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液，1 500 r/min離心，棄上清液，用于檢測(cè)。中性粒細(xì)胞的分離純化：采用密度梯度離心法分離制備中性粒細(xì)胞。于腹主動(dòng)脈取血5 mL，加入裝有Percoll分離液的離心管中，400 g離心30 min，取中性粒細(xì)胞富集層，0.01 mol/L的PBS洗1遍，低滲法去除紅細(xì)胞，PBS重復(fù)洗1遍后加入PBS 4 mL懸浮成5×103個(gè)/mL，分別采用臺(tái)盼藍(lán)染色和瑞氏染色檢查細(xì)胞活力和純度后立即使用。肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類：取離心后的肺泡灌洗液沉淀，用1 mL PBS重懸細(xì)胞，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。同時(shí)，取20 μL的細(xì)胞懸液涂片，固定于染色架上，經(jīng)瑞氏染色后于光學(xué)顯微鏡下做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的凋亡：將分離純化的中性粒細(xì)胞用200 μL Binding Buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL， 每個(gè)樣本約為 100 μL， 加入 5 μL An nexin V和10 μL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞的凋亡率。3）蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)中性粒細(xì)胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)：采用RIPA裂解液進(jìn)行總蛋白提取，測(cè)定蛋白濃度；加入10%SDSPAGE蛋白上樣緩沖液進(jìn)行蛋白分離，電泳，轉(zhuǎn)膜；脫脂牛奶封閉 2 h，加入 KLF2（1∶1 500）、RelA（1∶1 500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和 β-actin（1∶500）一抗于4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，TBST緩沖液洗滌兩次，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，并以 β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 KLF-2、RelA、Bax和 Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的比較見(jiàn)表1。造模后，肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量顯著增加，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比均顯著升高，與空白組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量顯著減少，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比均顯著降低，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以瀉肺定喘湯高劑量組療效最佳。

表1 各組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的比較（x±s）

表1 各組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的比較（x±s）

與空白比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8嗜酸性粒細(xì)胞（%） 淋巴細(xì)胞（%）0.80±0.10 0.63±0.05 1.43±0.18** 1.11±0.06**1.02±0.08△△ 0.90±0.08△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 33.84±10.97 34.12±9.35 1.42±0.18 0.95±0.09△△瀉肺定喘湯中劑量組 8 19.25±7.19△△ 26.20±10.24△△ 1.15±0.13△△ 0.90±0.09△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 9.44±2.63△△ 18.20±6.69△△ 0.87±0.06△△ 0.70±0.04△△白細(xì)胞計(jì)數(shù)（105/mL） 中性粒細(xì)胞（%）7.61±1.27 10.23±2.87 36.75±9.79** 36.60±4.59**15.42±3.97△△ 20.72±4.95△△

2.2 各組中性粒細(xì)胞凋亡率的比較 見(jiàn)表2。造模后，模型組大鼠中性粒細(xì)胞的凋亡率顯著降低，與空白組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加哮喘大鼠中性粒細(xì)胞的凋亡，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組中性粒細(xì)胞凋亡率比較（x±s）

表2 各組中性粒細(xì)胞凋亡率比較（x±s）

組 別 n 細(xì)胞凋亡率（%）空白組 8 7.15±1.12模型組 8 4.07±1.01**地塞米松組 8 8.83±3.13△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 5.48±1.44瀉肺定喘湯中劑量組 8 7.88±1.09△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 12.05±3.91△△

2.3 各組中性粒細(xì)胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表3～表4，圖1～圖2。造模后，模型組大鼠中性粒細(xì)胞中KLF2、RelA蛋白的表達(dá)及KLF-2/RelA的比值顯著降低，與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加中性粒細(xì)胞中KLF2、RelA蛋白的表達(dá)及上調(diào)KLF-2/RelA的比值，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。造模后，模型組大鼠中性粒細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加中性粒細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)及上調(diào)Bax/Bcl-2的比值，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組中性粒細(xì)胞中KLF2和RelA蛋白表達(dá)的比較（x±s）

表3 各組中性粒細(xì)胞中KLF2和RelA蛋白表達(dá)的比較（x±s）

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8 KLF2/RelA 2.66±0.72 1.24±0.28**3.00±0.56△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 0.19±0.06 0.13±0.02 1.57±0.76瀉肺定喘湯中劑量組 8 0.34±0.04△△ 0.17±0.02△△ 2.03±0.33△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 0.59±0.06△△ 0.19±0.05△△ 3.31±1.04△△KLF2/β-actin RelA/β-actin 0.60±0.16 0.23±0.04 0.12±0.01** 0.10±0.02**0.44±0.04△△ 0.15±0.02△△

圖1 各組中性粒細(xì)胞中KLF2和RelA蛋白的表達(dá)

表4 各組中性粒細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

表4 各組中性粒細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8 Bax/Bcl-2 3.39±1.24 0.40±0.08**1.14±0.21△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 0.42±0.04 0.68±0.05 0.62±0.09瀉肺定喘湯中劑量組 8 0.45±0.07△△ 0.51±0.07△△ 0.90±0.18△瀉肺定喘湯高劑量組 8 0.64±0.08△△ 0.36±0.08△△ 1.91±0.56△△Bax/β-actin Bcl-2/β-actin 0.70±0.08 0.22±0.05 0.31±0.05** 0.79±0.11**0.57±0.07△△ 0.51±0.05△△

圖2 各組中性粒細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

3 結(jié) 論

NA作為哮喘的一個(gè)獨(dú)立亞型，是導(dǎo)致患者病情控制不佳、激素治療反應(yīng)差的重要原因之一［9］。近年來(lái)的研究證實(shí)，該病與環(huán)境污染、吸煙、肥胖、衰老、急慢性呼吸道感染和大劑量糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用等有關(guān)，并且參與小氣道和小血管重構(gòu)，已成為當(dāng)前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)［10］。有研究顯示，中性粒細(xì)胞過(guò)量的聚集，與氣道中性粒細(xì)胞清除受損、凋亡延遲及相關(guān)趨化因子的增加有關(guān)［11］?；罨闹行粤＜?xì)胞能夠分泌炎性因子（如INF-γ、IL-6及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等），同時(shí)升高的趨化因子（如白三烯B4及TNF-α等）還能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞由循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肺組織中，加重炎癥反應(yīng)［12］。

KLF-2是鋅指Krüppel樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員之一，因其最初發(fā)現(xiàn)在肺內(nèi)高度表達(dá)，所以命名為肺Krüppel樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［13-14］。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，KLF-2能夠通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1和核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路的活化，從而抑制促炎因子的表達(dá)、炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化及炎癥細(xì)胞的黏附，從而發(fā)揮抗炎的作用［15］。 RelA（p65）是 NF-κB 家族成員之一，作為關(guān)鍵的抗凋亡信號(hào)和二聚體狀態(tài)下NF-κB最重要的功能亞基，RelA在中性粒細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用，而KLF-2/RelA的比例失衡能夠調(diào)控哮喘患者中性粒細(xì)胞的凋亡，并且隨著病情的加重，KLF-2/RelA 比值逐漸降低［16］。Bax 和 Bcl-2 是目前Bcl-2家族研究較多的凋亡調(diào)控基因，其中Bcl-2能夠通過(guò)阻斷凋亡途徑，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，延長(zhǎng)細(xì)胞的存活［17］。而B(niǎo)ax作為分子量為21 kDa的蛋白，能夠拮抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡，從而起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。因此，調(diào)控Bax/Bcl-2之間的平衡在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［18］。

哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮證”的范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于本病的描述，并稱其為“喘鳴”“喘喝”。本病病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)為主，其中邪實(shí)以痰為宿根，本虛則以肺脾腎臟虧虛為本。因此對(duì)于本病急性期，首當(dāng)以祛邪為主，瀉肺定喘湯為筆者所在醫(yī)院治療哮喘的經(jīng)驗(yàn)方，方由定喘湯合瀉白散化裁而來(lái)，方中麻黃宣肺平喘，白果斂肺祛痰，兩者一散一收，既能加強(qiáng)平喘的功效，又能防止麻黃耗傷肺氣。杏仁、紫蘇子、款冬花、法半夏降氣化痰、止咳平喘，在本方中共為臣藥。桑白皮、地骨皮、黃芩清肺泄熱，止咳平喘，為佐藥。炙甘草補(bǔ)脾和胃、調(diào)和諸藥，為使。全方共奏宣降肺氣、清熱化痰、止咳平喘的功效。

本研究結(jié)果顯示，瀉肺定喘湯能夠顯著抑制模型大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞的數(shù)量，降低中性粒細(xì)胞的比例，增加中性粒細(xì)胞的凋亡。另一方面，瀉肺定喘湯能夠顯著增加中性粒細(xì)胞中KLF2、RelA和Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)KLF-2/RelA和Bax/Bcl-2的比值，與模型組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且瀉肺定喘湯的療效亦呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性。

綜上所述，瀉肺定喘湯能夠降低肺泡灌洗液中白細(xì)胞的數(shù)量和中性粒細(xì)胞的比例，因此我們推斷其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控KLF2/RelA的平衡實(shí)現(xiàn)的。