新塔花對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中TLR4/NF-κb信號通路的影響*

張 華 王思靜 邢 科 徐亦男 馬學寬 倪 昀 王 麗 安冬青

（新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830011）

心腦血管病是影響全球病死率最高的疾病，其發(fā)病率程升高趨勢，目前我國心血管病患者數(shù)約2.9億人次，而動脈粥樣硬化（AS）是缺血性心腦血管病的主要病理基礎［1］，有多種學說從不同的角度闡述其發(fā)病機制。近些年關(guān)于AS機制的研究取得了很大的進步，這對于防治AS進一步改善患者的生活質(zhì)量具有很大的意義。AS在不同的病理生理過程始終伴隨著炎癥反應。研究表明，組織受損能夠誘導免疫反應從而激活Toll樣受體 4（TLR4），介導下游因子，激活核因子-κb（NF-κb），啟動一系列的炎性因子轉(zhuǎn)錄，從而引起炎癥反應，導致血管損傷，導致 AS的發(fā)生［2-5］。

新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.），又名唇香草，主要分布在我國新疆，中亞及中東等部分地區(qū)。此藥具有安神、舒張血管、降血壓、抗炎止痛等功效，主要用于治療失眠、高血壓病、冠心病等疾?。?-8］。目前關(guān)于新塔花水提物治療AS的研究尚未報道，本實驗首次從其抗炎方面防治AS進行研究，以期為其進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只健康8周齡雄性，體質(zhì)量（20±2）g，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠，同品系C57普通小鼠，購于北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科技樓動物房，倫審編號：20171129-02。

1.2 試藥與儀器 新塔花全草，購于新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院（鑒定人：張選明，石河子大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，副主任醫(yī)師）。阿托伐他?。ㄅ?0151223，1 g/瓶，北京Solarbio公司）、HE染色試劑盒 （北京Solarbio公司）；ICAM、MMP-9 ELISA試劑盒 （上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；GAPDH、TLR4、p-NF-κbp65蛋白購于Elabscience生物公司；PBS緩沖液粉末（pH7.3，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；檸檬酸鹽修復液粉末 （PH6.0，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB 顯色液（invitrogen 公司，美國）；二抗（Anti-Rabbit，invitrogen公司，美國）。EG1150組織包埋機（SAKURA，日本）；RM2235 石蠟切片機（Leica公司，德國）；5424R 低溫高速離心機（Eppendrof，德國）；光學顯微鏡（LEICA DM 2500，德國）；Type1500 多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）等。

1.3 分組方法 將40只8周齡ApoE（-/-）小鼠適應性飼養(yǎng) 1周后，隨機分為模型組（MX）、他汀組（TT）、新塔花水提物高劑量組 （XG）、新塔花水提物低劑量組（XD），每 10只；同品系 C57小鼠 10只為空白組（KB）；高脂飼料室溫飼養(yǎng)。第 2 周開始，TT 組［3 mg/（kg·d）］，XG 組［3.6 g/（kg·d）］，XD 組［0.9 g/（kg·d）］3 組開始藥物灌胃干預，MX組和KB組灌胃等量蒸餾水。

1.4 新塔花水提物的制備 取干燥芳香新塔花全草24 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，加熱回流2 h后洗滌濾渣，水提率75%，置于旋蒸燒瓶內(nèi)真空加熱1 h，得水提物80 mL左右，定容至100 mL即為所需新塔花高劑量（含生藥0.18 g/mL），稀釋2倍為低劑量（含生藥0.045 g/mL）。

1.5 給藥方法 小鼠實驗用藥量換算公式為：［g/（kg·d）］=9.1×成人臨床常藥量 ［g/（kg·d）］， 每次灌胃 0.5 mL（0.1～0.3 mL/10 g）/d，每周按照體質(zhì)量調(diào)整給藥濃度。MX組和KB組給予0.5 mL蒸餾水灌胃。所有小鼠自由活動，不限飲食飲水。高脂飼料配方：基礎飼料82.68%，豬油10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆醫(yī)科大學動物中心加工。

1.6 標本采集與檢測 所有小鼠灌胃12周末禁食不禁水12 h后，處死小鼠進行以下操作：1）眼球取血后，3 500 r/min離心15 min，取上清置于Ep管內(nèi)用于ELISA和血脂檢測；2）打開胸腹腔，無菌條件下取出小鼠胸主動脈置于4%多聚甲醛固定用于HE染色，升主動脈和主動脈弓置于4%多聚甲醛固定用于免疫組化。胸主動脈與升主動脈甲醛固定48小時，依次經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進行切片，每個組織連續(xù)切片4 μm厚度5張；按照試劑盒操作，HE染色，依次經(jīng)過觀察小鼠主動脈形態(tài)學變化并拍照；ELISA法依次經(jīng)加樣、溫育、配液洗滌、拍干、加酶、顯色、終止等步驟。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度（OD）值，以濃度值為橫坐標（X），各標準OD值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，利用標準曲線計算出小鼠血清中ICAM-1和 MMP-9濃度值。IHC法檢測 TLR4、NF-κbp65蛋白陽性面積表達，經(jīng)烤片、脫蠟、修復、抗體孵育、過夜、顯色、復染、封片等步驟，在光鏡下觀察主動脈形態(tài)學變化并拍照，運用進行Image J軟件進行陽性面積分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗。P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血脂水平比較 見表1。與KB組比較，MX 組三酰甘油（TAG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）明顯降低（P＜0.01）；與 MX 組比較，TT 組、XG組、XD組 TAG及TC降低明顯 （P＜0.01），TT組HDL-C 和 LDL-C 略升高 （P＞0.05），XG 組、XD 組HDL-C升高明顯 （P＜0.01），XG組、XD組 LDL-C均降低（P＜0.01）；與TT組比較，XG組各指標具有明顯的差異（P＜0.01）。

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

與 KB組比較，*P＜0.01；與 MX 組比較，△P＜0.01；與 TT組比較，#P＜0.01。 下同

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 LDL-C 0.36±0.06 5.84±0.94*6.04±0.19 XG 組 6 0.85±0.15△# 9.81±0.08△#0.99±0.07△#3.86±0.33△#XD 組 6 1.06±0.18△ 10.07±0.96△ 0.9±0.15△ 4.3±0.37△TAG TC HDL-C 0.64±0.01 2.75±0.04 2.17±0.1 1.34±0.07* 15.32±1.01* 0.62±0.01*0.97±0.08△ 13.53±2.86△ 0.63±0.08

2.2 各組小鼠胸主動脈病理形態(tài)學變化 胸主動脈HE染色中，KB組管壁幾乎無脂質(zhì)沉積，管腔無明顯狹窄。MX組血管壁明顯增厚，出現(xiàn)大量的脂質(zhì)沉積和炎癥細胞浸潤，管腔狹窄明顯；XG組動脈粥樣斑塊面積明顯小于MX組，大于KB組；XD組血管壁增厚，內(nèi)部脂質(zhì)沉淀和斑塊略低于MX組，管腔有狹窄。TT他汀組管腔狹窄不明顯，斑塊面積小于MX組，血管損傷小，脂質(zhì)沉積較少。見圖1。

圖1 小鼠胸主動脈病理形態(tài)學變化（HE染色，200倍）

2.3 各組小鼠血清中ICAM-1和MMP-9表達水平比較 見表2。與KB組比較，MX組ICAM-1和MMP-9水平升高（P＜0.01）；與 MX 組比較，TT 組、XG 組、XD組ICAM-1和MMP-9水平均明顯低于MX組 （P＜0.01）；XG組與TT組比較，ICAM-1水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），MMP-9水平差異明顯有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清ICAM-1和MMP-9表達水平比較（x±s）

表2 各組小鼠血清ICAM-1和MMP-9表達水平比較（x±s）

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 ICAM-1 MMP-9 435.35±9.73 63.31±0.54 581.54±15.26* 87.65±1.55*423.90±2.47△ 70.01±1.57△XG 組 6 416.57±22.06△ 56.06±1.42△#XD 組 6 475.87±3.18△ 70.85±0.07△

2.3 各組小鼠升主動脈中TLR4、NF-κb免疫組化結(jié)果比較 見表3。研究結(jié)果表明，與KB組比較，模型組中TLR4和NF-κb積分光密度值上升（P＜0.01）；與MX組比較，TT組、XG組TLR4積分光密度值均下降（P＜0.01），XD 組無明顯差異（P＞0.05）；與 MX 組比較，TT組、XG 組、XD 組 NF-κb積分光密度值均下降（P＜0.01）。與TT組比較，XG組TLR4積分光密度值無差異（P＞0.05），XG 組 NF-κb積分光密度值較低（P＜0.05）。

表3 各組小鼠升主動脈組織中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比較（x±s）

表3 各組小鼠升主動脈組織中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比較（x±s）

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 TLR4 NF-κb 7.36±0.40 4.67±0.24 13.74±1.31* 9.53±0.78*9.77±0.80△ 7.79±0.25△XG 組 6 9.81±0.51△ 6.49±0.33△#XD 組 6 13.31±1.15*△ 7.76±0.51△

3 討 論

新塔花全草中的化學成分主要為揮發(fā)油和非揮發(fā)油（總黃酮等）兩部分。新塔花揮發(fā)油為透明淡黃色油狀液體，約占全草的2%［9］。國外有學者采用GC和GC-MS法對伊朗地區(qū)新塔花進行化學分析，得出新塔花揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)27種成分，主要的化合物包括胡薄荷酮（44.5%）等［10］。大量研究表明新塔花具有抗心肌缺血、抗炎殺菌、舒張血管、抗氧化等作用，近些年受到廣泛的關(guān)注和研究［11-17］。

本研究觀察新塔花對動脈粥樣硬化模型小鼠TLR4/NF-κb信號通路的影響，結(jié)果顯示，各藥物干預組TLR4、NF-κb的表達水平明顯低于模型對照組，表明新塔花可能通過降低TLR4/NF-κb信號通路內(nèi)的蛋白表達水平，降低細胞間黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，最終抑制炎癥反應，起到防治AS的效果。研究結(jié)果還顯示新塔花高劑量組比低劑量組藥效明顯，說明該藥具有一定的劑量依賴性。

該實驗對新塔花的研究為進一步拓展新塔花資源，發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點、多層面和個體化的優(yōu)勢，尤其是應用于防治以AS為基礎的心腦血管疾病，具有重要指導意義，為新塔花在心血管病研究中提供了科學依據(jù)和理論基礎。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，有待深入的研究。如果并不是所有生物堿都能以抑制信號通路、抗炎為靶向防治心腦血管疾病，筆者推斷新塔花揮發(fā)油可能會是抗炎的主要成分，其藥效學和機制有待進一步研究。