核桃內(nèi)果皮4-香豆酸輔酶A連接酶基因克隆及表達(dá)分析

郭永翠，秦江南，朱 玲，張 銳

(1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300; 3.南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；4.新疆伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 新疆 伊寧 835000)

新疆核桃(JuglansregiaL.)殼薄、早實(shí)豐產(chǎn)、出仁率高且種仁飽滿，其中紙皮核桃品質(zhì)尤為突出，成為近年消費(fèi)熱點(diǎn)[1]。紙皮核桃殼厚小于1 mm (大多在0.5～0.8 mm)，出仁率達(dá)65%以上，種仁飽滿，內(nèi)果皮發(fā)育完整，其中溫138核桃是紙皮核桃栽培園中發(fā)現(xiàn)的突變株，其平均出仁率高達(dá)83.2%，產(chǎn)量極高，果殼極薄、極易脫皮，但殼面(內(nèi)果皮發(fā)育不完整)開裂導(dǎo)致露仁，是適于核桃深加工的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源[2-3]。

木質(zhì)素是核桃內(nèi)果皮(硬殼)的主要成分，且是內(nèi)果皮中難分解的大分子有機(jī)物質(zhì)，其沉積出現(xiàn)在次生加厚的細(xì)胞壁中以提高細(xì)胞壁的強(qiáng)度及硬度，對核桃內(nèi)果皮發(fā)育影響較大[4-5]。其中4CL是起到連接木質(zhì)素前體及各個(gè)分支反應(yīng)作用的關(guān)鍵限速酶，在木質(zhì)素生物合成途徑中4CL分別催化對-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成相應(yīng)的輔酶A酯，促進(jìn)木質(zhì)素單體的合成[6-7]。通過活化基團(tuán)生成相應(yīng)輔酶A酯，從而促進(jìn)木質(zhì)素單體生成單加氧酶[8]。目前已從慈竹(Neosinocalamusaffinis)[9]、青稞(Hullessbarey)[10]、亞麻(LinumusitatissimumL.)[11]、芒果(Mangiferaindica)[12]、白樺(Betulaplatyphylla)[13]、甜高粱(Sorghumdochna(Forssk.)Snowden)[14]等多種植物中克隆并編碼4CL基因，在擬南芥、煙草、白楊、毛白楊等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制4CL基因表達(dá)會引起植物體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低，其中S/G比值卻會根據(jù)植物種類的不同而有所差異，在擬南芥植株中G-木質(zhì)素的含量顯著降低，在煙草植株中S-木質(zhì)素的含量顯著降低，而在白楊中植株S/G卻沒有明顯變化[15-16]。然而關(guān)于溫138核桃露仁現(xiàn)象及其與之相關(guān)的核桃內(nèi)果皮硬化過程中木質(zhì)素沉積的系統(tǒng)分子機(jī)制尚不明確。

本研究擬通過對溫138、紙皮核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵酶4CL基因進(jìn)行克隆及時(shí)空表達(dá)模式的分析來研究4CL基因的表達(dá)特性，旨在為進(jìn)一步研究4CL基因在核桃不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式及為核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的基因改造提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料露仁核桃溫138及硬殼發(fā)育完整紙皮核桃，均采自新疆維吾爾自治區(qū)溫宿縣核桃木本糧油林場。在果實(shí)膨大期后期6月7日(約花后51 d)至硬核期7月26日(約花后100 d)采樣，采樣覆蓋整個(gè)核桃內(nèi)果皮硬化期。

1.2 核桃內(nèi)果皮總RNA提取及cDNA合成

利用EZNA Plant RNA Kit試劑盒(Omega公司)提取核桃內(nèi)果皮中總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測及鑒定PCR產(chǎn)物的濃度、純度和亮度。采用cNDA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 核桃內(nèi)果皮4CL基因的克隆

利用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，溫138核桃引物4CL-F：5′-TCAACTTGGAAGACCAGCAGCCA-3′及4CL-R：5′-AGCCTCCGCTCTCACCAGCA-3′，RT-PCR反應(yīng)體系20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃/3 min(預(yù)變性)；94 ℃ 45 s(變性)，61 ℃ 45 s (退火)，72 ℃ 2 min (延伸)，31個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min (繼續(xù)延伸)；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并成像，后將擴(kuò)增的目的條帶進(jìn)行回收并連接到PMD-18T載體，篩選出陽性克隆測序。

1.4 4CL基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)WJ-4CL、ZJ-4CL基因序列，推導(dǎo)氨基酸序列,采用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast功能進(jìn)行在線4CL序列匹配度、同源性分析；ORF Finder檢測cDNA序列的開放閱讀框；采用MAGA 5.1軟件(Neighbor-Joining)構(gòu)建4CL基因與其他相似性高的植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹。運(yùn)用ExPASy數(shù)據(jù)庫ProtParam功能分析核桃內(nèi)果皮WJ-4CL、ZJ-4CL蛋白的相對分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)量及理論等電點(diǎn)等相關(guān)理化性質(zhì)。采用PredictProtein在線平臺分析4CL蛋白二級結(jié)構(gòu)，選用在線同源服務(wù)軟件SWISS-MODEL預(yù)測4CL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.5 4CL基因的表達(dá)分析

以18S為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測4CL基因的相對表達(dá)量。根據(jù)已克隆的核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素4CL基因序列，按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物原則，分別設(shè)計(jì)溫138、紙皮核桃4CL基因熒光定量PCR引物，露仁種質(zhì)溫138核桃PCR引物4CL-WF：5′-AATCTCGGTGTTGGGAAGG-3′，4CL-WR：5′-CTTTGGAGGATTTCGCTTG-3′；硬殼完整種質(zhì)紙皮核桃PCR引物4CL-ZF：5′-CTTGCTACTCAC CCATCCTAAC-3′，4CL-ZR：5′-CACTTGATCGCACC ACAAAA-3′；內(nèi)參基因引物：NBQ-F：5′-AGTCGTAA CAAGGTTTCCGTAGGT-3′；NBQ-R: 5′-GCTGGGCAG GTATCGACAAT-3′。以溫138及紙皮核桃8個(gè)時(shí)期的cDNA為模板，采用兩步法進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線生成步驟：58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s,55 ℃ 20 min,95 ℃ 15 s。利用2-ΔΔCt方法[17]分別計(jì)算4CL基因在硬殼完整和露仁核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃內(nèi)果皮總RNA的提取及檢測

核桃內(nèi)果皮中總RNA凝膠成像呈現(xiàn)較清晰完整的28S rRNA和18S rRNA條帶，5S rRNA條帶較模糊，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍，測得核酸濃度A260/280為1.90～2.20，說明提取的總RNA有較高的純度(圖1)。

2.2 核桃內(nèi)果皮4CL基因的克隆

以溫138和紙皮核桃內(nèi)果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(圖2)，得到露仁核桃WJ-4CL基因及硬殼完整核桃ZJ-4CL基因。WJ-4CL基因片段長度為1 000 bp (含有552 bp的ORF)，編碼184個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量20.10 ku，理論等電點(diǎn)5.83，屬于酸性蛋白；ZL-4CL基因片段長度1 000 bp (含有453 bp的ORF)，編碼151個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量16.52 ku，理論等電點(diǎn)9.35，屬于堿性蛋白。

圖1 電泳檢測核桃內(nèi)果皮總RNAFig.1 Electrophoresis of total RNA from walnut endocarp

M.DL2000 DNA Marker; 1.溫138核桃; 2.紙皮核桃。M.DL2000 DNA Marker; 1.Wen 138 walnut; 2.Zhipi walnut.

A.WJ-4CL基因的結(jié)構(gòu)域分析; B.ZJ-4CL基因的結(jié)構(gòu)域分析。A.Domain analysis of WJ-4CL gene; B.Domain analysis of ZJ-4CL gene.

2.3 4CL基因生物信息學(xué)分析

2.3.14CL基因序列分析 將本研究獲得的2個(gè)基因相似性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與其他植物4CL基因序列有較高的匹配度。結(jié)果顯示，核苷酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺的4CL基因序列匹配度最高，其相似性達(dá)到83%以上，其中均與光皮樺的匹配度最高，相似性分別達(dá)到86%，83%。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP在線分析可知，WJ-4CL和ZL-4CL與光皮樺、白樺等其他植物推導(dǎo)氨基酸序列相似性均在70%以上。4CL推導(dǎo)氨基酸序列發(fā)現(xiàn),WJ-4CL與ZL-4CL均存在一個(gè)4CL非特異性位點(diǎn)，WJ-4CL基因推導(dǎo)氨基酸序列存在PLN02246、AMP-binding、CaiC及l(fā)igase_PEP_1 4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，ZL-4CL基因推導(dǎo)氨基酸序列含有cyc_hxne_CoA_lg、PLN02246、CaiC及AMP-binding 4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，WJ-4CL與ZL-4CL推導(dǎo)氨基酸序列均為多結(jié)構(gòu)域蛋白(AFD_class_Ⅰ)超家族(圖3)。

2.3.24CL基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將本研究獲得的WJ-4CL、ZJ-4CL基因核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(圖4)，露仁種質(zhì)溫138克隆所得WJ-4CL基因和硬殼完整品種紙皮克隆所得ZJ-4CL基因序列一致性為74.76%。經(jīng)過Blast在線比對，發(fā)現(xiàn)WJ-4CL及ZJ-4CL基因與其他植物的4CL基因具有較高的相似性，選取與WJ-4CL及ZJ-4CL相似性較高的19種植物構(gòu)建核桃4CL基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，核桃與喬木類植物親緣關(guān)系較近，白樺、歐洲白樺與光皮樺等樺樹較好的聚為一支，野草莓與覆盆子這2個(gè)薔薇目植物聚為同一支，薔薇科梨屬的沙梨與蕓香科花椒屬花楸樹聚為同一支，且自展值均為100，其他植物也各自與相近的植物聚為一支。硬殼完整核桃紙皮 (ZJ-4CL)與露仁核桃種質(zhì)溫138 (WJ-4CL)聚為同一支，這說明就4CL基因而言，硬殼完整核桃紙皮與露仁種質(zhì)溫138核桃的親緣關(guān)系較近，但具有較遠(yuǎn)的遺傳距離，可能由于4CL基因在不同品種間的差異性所導(dǎo)致。

圖4 WJ-4CL及ZJ-4CL基因多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of WJ-4CL and ZJ-4CL gene

2.4 4CL蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

WJ-4CL、ZJ-4CL蛋白的氨基酸序列在線預(yù)測分析(圖6)。表明WJ-4CL蛋白含有32.34%的無規(guī)則卷曲和30.06%的α-螺旋，是WJ-4CL蛋白二級結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件，其次含有27.87%的延伸鏈和9.29%的β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)元件。ZJ-4CL蛋白主要含有39.33%的α-螺旋，是ZJ-4CL蛋白二級結(jié)構(gòu)中最為重要的結(jié)構(gòu)元件，其次含有28.00%延伸鏈、22.00%的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)及10.67%的β-轉(zhuǎn)角。

圖5 核桃與19種植物4CL基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of 4CL gene in walnut and 19 other plants

A.WJ-4CL蛋白二級結(jié)構(gòu); B.ZJ-4CL蛋白二級結(jié)構(gòu); h.α-螺旋; e.延伸鏈; t.β-轉(zhuǎn)角; c.無規(guī)則卷曲。A.Secondary structure of WJ-4CL protein; B.Secondary structure of ZJ-4CL protein; h.Alpha helix; e.Extended strand; t.Beta turn; c.Randon coil.

2.5 4CL蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

分別建立WJ-4CL與ZJ-4CL蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型(圖7)。WJ-4CL與ZJ-4CL這2種蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中均以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，其他元件較少。蛋白三級結(jié)構(gòu)分析可知WJ-4CL較ZJ-4CL結(jié)構(gòu)復(fù)雜得多，其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)等元件含量較多。

A.WJ-4CL蛋白三級結(jié)構(gòu); B.ZJ-4CL蛋白三級結(jié)構(gòu)。A.The tertiary structure of WJ-4CL protein; B.The tertiary structure of ZJ-4CL protein.

2.6 WJ-4CL、ZJ-4CL基因相對定量分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析WJ-4CL、ZJ-4CL在核桃內(nèi)果皮硬化過程中的表達(dá)水平(圖8)。WJ-4CL、ZJ-4CL基因相對表達(dá)量在核桃的8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期中有非常明顯的差異，其中WJ-4CL基因相對表達(dá)量最高的花后100 d (117.78)是相對表達(dá)量最低的花后51 d (1.00)的117倍，ZJ-4CL基因相對表達(dá)量最高的花后86 d (205.07)是相對表達(dá)量最低的花后51 d (1.00)的205倍。由圖可以看出，溫138核桃內(nèi)果皮硬化過程表達(dá)量呈現(xiàn)增長-降低-增長趨勢，相對表達(dá)整體呈現(xiàn)“N”型變化趨勢，其前期4CL基因表達(dá)量相對較小，至核桃內(nèi)果皮硬化過程的后期其4CL基因大量表達(dá)；而紙皮核桃內(nèi)果皮硬化過程表達(dá)量呈現(xiàn)增長-降低-增長-降低趨勢，相對表達(dá)整體呈現(xiàn)“M”型變化趨勢，花后86 d4CL基因表達(dá)量急劇下降。4CL基因在硬殼完整核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于同期露仁核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量。

A.WJ-4CL基因相對表達(dá)量; B.ZJ-4CL基因相對表達(dá)量;06-07.花后51 d;06-13.花后57 d; 06-21.花后65 d; 06-28.花后72 d; 07-04.花后78 d; 07-12.花后86 d; 07-20.花后94 d; 07-26.花后100 d; 不同小寫字母表示不同時(shí)期之間的顯著性差異(P<0.05)。

A. Relative expression ofWJ-4CLgene; B.Relative expression ofZJ-4CLgene; 06-07.51 d after anthesis; 06-13.57 d after anthesis; 06-21.65 d after anthesis; 06-28.72 d after anthesis; 07-04.78 d after anthesis; 07-12.86 d after anthesis; 07-20.94 d after anthesis; 07-26.100 d after anthesis; Different lowercase letters indicate significant differences between different periods (P<0.05).

圖8 核桃內(nèi)果皮硬化過程4CL基因相對表達(dá)水平
Fig.8 Relative expression level of4CLgene during hardening of walnut endocarp

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)克隆得到露仁核桃種質(zhì)溫138及硬殼發(fā)育完整核桃種質(zhì)紙皮內(nèi)果皮4CL基因，分別命名為WJ-4CL與ZJ-4CL，利用生物信息學(xué)預(yù)測獲得4CL基因的理化性質(zhì)參數(shù)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等，分析了4CL基因的進(jìn)化關(guān)系及在核桃內(nèi)果皮硬化過程中不同時(shí)期的相對表達(dá)特性。

WJ-4CL與ZJ-4CL基因均為AFD_class_Ⅰ蛋白超家族成員，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得知，WJ-4CL與ZJ-4CL推導(dǎo)氨基酸序列存在相同的非特異性位點(diǎn)(4CL)及功能結(jié)構(gòu)域(cyc_hxne_CoA_lg、PLN02246、CaiC及AMP-binding)，這一結(jié)果與珊瑚菜(Glehnialittoralis)[18]、華南象草(Pennisetumpurpureumcv. Huanan)[19]相關(guān)研究結(jié)果吻合。同源性分析顯示，核桃露仁種質(zhì)WJ-4CL基因與硬殼發(fā)育完整ZJ-4CL基因聚在一支，WJ-4CL、ZJ-4CL與喬木類植物親緣關(guān)系較近。WJ-4CL與ZJ-4CL核苷酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺4CL基因及其氨基酸序列的相似性均達(dá)到83%以上，2個(gè)基因編碼的氨基酸序列與光皮樺、白樺、歐洲白樺4CL基因推導(dǎo)氨基酸序列相似性均在70%以上。發(fā)現(xiàn)不同植物間4CL基因也有較高的一致性，推測4CL在核桃發(fā)育過程中對內(nèi)果皮(硬殼)完整程度有較大的影響。

本試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，溫138、紙皮核桃4CL基因在內(nèi)果皮硬化的8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的相對表達(dá)量存在顯著差異，其中WJ-4CL前期的相對表達(dá)量均較低，在核桃硬核期的花后100 d達(dá)到最大值，是前期的117倍，相對表達(dá)整體呈現(xiàn)“N”型變化趨勢，對照紙皮核桃ZJ-4CL在花后86 d達(dá)到最大值，是前期的205倍，相對表達(dá)整體呈現(xiàn)“M”型變化趨勢，這與董麗麗等[20]的紅玉石籽石榴(Punicagranatumcv. Hongyushizi)研究有一定的差別，紅玉石籽木質(zhì)素含量與4CL基因存在相關(guān)性，4CL基因的表達(dá)量呈現(xiàn)“∧”趨勢，前60 d木質(zhì)素大量合成和積累(4CL基因表達(dá)量升高)，當(dāng)木質(zhì)素含量高到一定程度其合成開始減弱(4CL基因表達(dá)量開始下降)，說明4CL基因參與調(diào)控木質(zhì)素合成。本研究與裴艷梅等[21]研究結(jié)果相吻合，在無核小棗(ZiziphusjujubaMill. Wuhexiaozao)4CL基因研究中發(fā)現(xiàn)，花期到花后50 d呈現(xiàn)先上升后下降的總趨勢，前期表達(dá)量很低，后期明顯上升。本試驗(yàn)相對定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4CL基因在硬殼完整核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于同期露仁核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量，說明露仁現(xiàn)象可能由于硬核期缺乏木質(zhì)素的積累。由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在硬核期木質(zhì)素的改變對核桃內(nèi)果皮的發(fā)育存在一定的影響，核桃出現(xiàn)露仁現(xiàn)象與4CL活性的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。