甜瓜果實(shí)成熟相關(guān)基因家族的全基因組鑒定及分析

郭呈宇，柳 俊，李園磊，安 睿，李星巖，哈斯阿古拉

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 作物育種與栽培研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

乙烯作為一種重要植物激素參與多個(gè)植物生長發(fā)育過程和應(yīng)答脅迫反應(yīng)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯合成存在2種系統(tǒng)，系統(tǒng)Ⅰ和系統(tǒng)Ⅱ[3]。系統(tǒng)Ⅰ完成基礎(chǔ)乙烯合成，主要存在于未成熟果實(shí)和營養(yǎng)生長的器官中，通過自身抑制的方式進(jìn)行調(diào)控；而系統(tǒng)Ⅱ參與果實(shí)成熟和花衰老時(shí)乙烯的大量合成，通過自身催化的方式調(diào)控[4-6]。在番茄中，系統(tǒng)Ⅰ和系統(tǒng)Ⅱ由不同的ACO、ACS家族成員參與[4,7-8]。

乙烯合成關(guān)鍵酶ACO和ACS基因受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Lin等[9]發(fā)現(xiàn)1個(gè)亮氨酸拉鏈蛋白的同源蛋白LeHB1結(jié)合在番茄LeACO1基因啟動(dòng)子9 bp 的AATA(A)TATT或10 bp 的AATA(AA)TATT特定序列上，對(duì)該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。通過病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，當(dāng)LeHB1基因下調(diào)后，LeACO1基因的表達(dá)受到了抑制，果實(shí)的成熟也被延遲。Ito等[10]通過染色質(zhì)免疫沉淀PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，番茄的1個(gè)MADS-box蛋白LeMADS-RIN(RIN)會(huì)特異性地結(jié)合到LeACS2啟動(dòng)子的CArG box區(qū)域。rin隱性突變的番茄果實(shí)成熟發(fā)育出現(xiàn)障礙，致使該植株既無法大量產(chǎn)生內(nèi)源性乙烯，又無法對(duì)外源乙烯做出應(yīng)答，導(dǎo)致果實(shí)無法成熟[11]。RIN被認(rèn)為是乙烯生物合成與調(diào)控中重要的上游調(diào)節(jié)蛋白。

乙烯進(jìn)入細(xì)胞后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)植物各種生理活動(dòng)。乙烯受體位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它首先感受乙烯信號(hào)，目前已經(jīng)鑒定的擬南芥乙烯受體共5個(gè)，即ETR1、 ETR2、 ERS1、ERS2、EIN4[12]。乙烯受體的下游組分CTR1也位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，與乙烯受體相互作用[13]。CTR1的C末端具有Ser/Thr激酶活性，而N末端可以與自磷酸化的乙烯受體如ETR1的組氨酸激酶域形成復(fù)合物，從而起到負(fù)調(diào)控乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[14]。

本研究在甜瓜全基因組范圍內(nèi)鑒定了乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的4個(gè)基因家族HB(Homeo box)、RIN(Ripening inhibitor)、ETR(Ethylene receptor)和CTR(Constitutive triple reaction)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。以甜瓜品種河套蜜瓜原種和內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系[15]為試驗(yàn)材料，分析了上述基因在果實(shí)生長期和成熟期的表達(dá)特性，旨在為發(fā)掘與甜瓜果實(shí)成熟相關(guān)的基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甜瓜品種河套蜜瓜原種由內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的河套蜜瓜M9品系(以下簡稱M9)由內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育[14]。將2種材料播種于日光溫室，按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，盛花期人工自交授粉。采摘授粉后10 d(以下簡稱生長期)和30 d果實(shí)(以下簡稱成熟期)(圖1)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)材料采摘3顆果實(shí)，取中果皮組織，速凍于液氮，用于總RNA提取，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2 四個(gè)基因家族的全基因組鑒定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已確認(rèn)功能的基因序列，找到番茄LeETR1、LeMADS-RIN1、LeHB1基因和擬南芥AtCTR1基因作為探針基因，并查找各自對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(表1)，下載FASTA格式的序列文件。然后將該FASTA文件輸入InterPro數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，將探針基因中所有功能域所在區(qū)域的序列作為探針序列。再將探針序列分別輸入甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(MELONOMICS)的Blast工具中，獲得具有與目標(biāo)功能域序列高度相似(E<10-10)序列的蛋白質(zhì)登錄號(hào)并下載其FASTA格式文件。最后將甜瓜數(shù)據(jù)庫中篩選到的序列輸入InterPro數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證，剔除功能域不完整的序列，獲得相應(yīng)的基因家族成員。

A．M9生長期果實(shí)；B.河套蜜瓜原種生長期果實(shí)；C.M9成熟期果實(shí)；D.河套蜜瓜原種成熟期果實(shí)。A.M9 fruit at the growth stage; B.Hetao melon fruit at the growth stage; C.M9 fruit at the ripening stage; D.Hetao melon fruit at the ripening stage.

基因名稱Gene name登錄號(hào)Accession number序列描述Sequence description長度/bpLengthLeHB1350537501同源域亮氨酸拉鏈蛋白188LeMADS-RIN1350534764MADS盒轉(zhuǎn)錄因子異構(gòu)體1149LeETR1350534616乙烯受體386AtCTR130680171CTR1絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶549

1.3 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

將鑒定獲得的蛋白序列使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行比對(duì)，獲得保守序列。使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線軟件預(yù)測(cè)各基因家族蛋白序列的保守基序。

1.4 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用康為世紀(jì)公司TRIzol總RNA提取試劑盒，按照說明書提取總RNA。對(duì)總RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)和純度檢測(cè)后交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.5 基因的表達(dá)量分析

從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中提取4個(gè)基因家族成員的表達(dá)量FPKM值(Fragments per kilobase of transcript per milion fragment mapped)，使用R 語言工具的 Pheatmap 拓展包繪制聚類熱圖(Heatmap)。篩選高表達(dá)基因，使用SPSS 22.0版本進(jìn)行方差分析，獲得基因差異表達(dá)顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 四個(gè)基因家族的全基因組鑒定

對(duì)4個(gè)基因在甜瓜中進(jìn)行全基因組鑒定發(fā)現(xiàn)，CmETR家族有3個(gè)成員、CmCTR家族有20個(gè)成員，CmHB家族有17個(gè)成員，CmRIN家族有21個(gè)成員(表2)。

2.2 四個(gè)基因家族編碼蛋白氨基酸序列分析

對(duì)4個(gè)家族成員的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同家族的氨基酸序列均存在較多的保守位點(diǎn)，序列相似性較高，說明基因家族鑒定結(jié)果是可靠的。CmETR家族的3個(gè)成員序列相似度較高，保守序列位點(diǎn)分布的位置較廣(圖2-A)，這暗示該家族可能存在多個(gè)保守基序。進(jìn)一步對(duì)該家族保守基序分析發(fā)現(xiàn)，基序1，2，3，4的保守性較高(圖3-A)，這與序列比對(duì)結(jié)果具有一致性。蛋白質(zhì)的低級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)決定其功能。該家族成員具有較高的位點(diǎn)保守性，暗示其在甜瓜中的功能也可能非常相近。CmCTR家族保守序列集中在2個(gè)位置(圖2-B)，對(duì)其保守基序分析發(fā)現(xiàn)，基序1，2的保守性最高(圖3-B)，這2個(gè)保守基序可能是該家族基因共有的功能位點(diǎn)。CmHB和CmRIN兩家族的保守序列相對(duì)集中(圖2-C-D)，分別對(duì)2個(gè)家族的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，CmHB的基序5(圖3-C)和CmRIN的基序6(圖3-D)都是非常保守，是這2個(gè)家族成員的典型特征序列。

表2 四個(gè)基因家族成員鑒定結(jié)果Tab.2 The identification of four gene families

A.CmETR家族氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；C.CmHB家族氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。A.Sequence alignment of CmETR family; B.Sequence alignment of CmCTR family; C.Sequence alignment of CmHB family; D.Sequence alignment of CmRIN family.

A.CmETR家族氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果；B.CmCTR家族氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果；C.CmHB家族氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果；D.CmRIN家族氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果。A.Motifs analysis of CmETR family; B.Motifs analysis of CmCTR family; C.Motifs analysis of CmHB family; D.Motifs analysis of CmRIN family.

2.3 四個(gè)基因家族在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)分析

對(duì)4個(gè)基因家族的表達(dá)量聚類結(jié)果(圖4)分析發(fā)現(xiàn)，CmETR、CmCTR和CmHB 3個(gè)家族成員在2個(gè)材料(M9和河套蜜瓜原種)中的表達(dá)量聚為兩類，即生長期的表達(dá)量聚為一類，成熟期的表達(dá)量聚為一類；而CmRIN家族的表達(dá)量分為3類，2個(gè)材料成熟期的表達(dá)量聚為一類，生長期的河套蜜瓜原種和生長期的M9的表達(dá)量各為一類。

CmETR家族3個(gè)成員中CmETR1基因在2個(gè)材料中的2個(gè)時(shí)期均有較高水平的表達(dá)，CmETR2和CmETR3則均表現(xiàn)出基因下調(diào)趨勢(shì)。

A.CmETR家族成員表達(dá)量熱圖；B.CmCTR家族成員表達(dá)量熱圖；C.CmHB家族成員表達(dá)量熱圖；D.CmRIN家族成員表達(dá)量熱圖；DF_M_group_fpkm.M9生長期果實(shí)；DF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種生長期果實(shí)；RF_M_group_fpkm.M9成熟期果實(shí)；RF_C_group_fpkm.河套蜜瓜原種成熟期果實(shí)。

A.Heatmap of CmETR family expression; B.Heatmap of CmCTR family expression; C.Heatmap of CmHB family expression; D.Heatmap of CmRIN family expression; DF_M_group_fpkm.M9 fruit at the growth stage; DF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at the growth stage; RF_M_group_fpkm.M9 fruit at ripening stage; RF_C_group_fpkm.Hetao melon fruit at ripening stage.

圖4 四個(gè)基因家族在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中表達(dá)量的熱圖
Fig.4 Heatmap of the four gene families expression in different fruits

CmCTR的20個(gè)成員中CmCTR1、CmCTR12在原種和M9的生長期果實(shí)中的表達(dá)水平均略高于成熟期，CmCTR15則具有相反表達(dá)模式。CmCTR8和CmCTR20在2個(gè)材料的果實(shí)中均有表達(dá)，在生長期和成熟期的表達(dá)量沒有明顯變化。CmCTR2在M9的成熟期果實(shí)中的表達(dá)水平略高于河套蜜瓜原種。CmCTR17和CmCTR5在河套蜜瓜原種中下調(diào)，而在M9材料中表達(dá)上調(diào)，但需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CmCTR7在河套蜜瓜原種與M9中2個(gè)時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)變化相同，均呈現(xiàn)上調(diào)。

CmHB家族17個(gè)成員中CmHB4和CmHB9的表達(dá)在2個(gè)材料中均表現(xiàn)出上調(diào)，其中CmHB4在生長期幾乎不表達(dá)，在成熟期果實(shí)中則大量表達(dá)。CmHB12和CmHB15則與CmHB4表達(dá)模式相反，其在2個(gè)材料中均表現(xiàn)下調(diào)。CmHB3在2個(gè)材料的成熟期果實(shí)中均有微量表達(dá)。CmHB5在2個(gè)材料的生長期果實(shí)中均有較高水平的表達(dá)。CmHB11在2個(gè)材料中均明顯表現(xiàn)下調(diào)模式。CmHB13在河套蜜瓜原種的2個(gè)時(shí)期表達(dá)水平均很低。

CmRIN家族的21成員中CmRIN2在2個(gè)材料的表達(dá)量表現(xiàn)出一致的下調(diào)模式，但其表達(dá)水平較低。CmRIN3在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)水平整體較高且表現(xiàn)出上調(diào)。CmRIN14和CmRIN15在2個(gè)材料成熟期果實(shí)中的表達(dá)水平相近，但在不同材料中的表達(dá)模式相反。CmRIN18的表達(dá)水平整體較低。

2.4 四個(gè)家族基因表達(dá)差異分析

篩選FPKM值大于1的所有基因，對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量進(jìn)行方差分析，由圖5可看出，河套蜜瓜原種2個(gè)時(shí)期顯著差異表達(dá)的基因有13個(gè)，除了CmHB5以外，其余12個(gè)基因的表達(dá)量在M9的2個(gè)時(shí)期也呈顯著性差異。這12個(gè)基因分別是：CmETR2、CmETR3、CmCTR12、CmHB3、CmHB4、CmHB9、CmHB11、CmHB12、CmHB15、CmRIN2、CmRIN14、CmRIN15。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在河套蜜瓜原種中CmHB3和CmHB11生長期的表達(dá)量是成熟期的42，9倍，而CmHB4成熟期的表達(dá)量是生長期的27倍，其表達(dá)量均呈極顯著差異；在M9中CmHB3和CmHB11生長期的表達(dá)量是成熟期表達(dá)量的6,3倍，而CmHB4成熟期的表達(dá)量是生長期的41倍，其表達(dá)量均呈極顯著差異。

另外發(fā)現(xiàn)，在生長期2個(gè)材料間有5個(gè)基因呈顯著性差異表達(dá)，其中除了CmHB11基因外，其余3個(gè)基因的表達(dá)量在成熟期的2個(gè)材料間也呈顯著性差異，這3個(gè)基因分別是CmHB3、CmRIN14、CmRIN15，其中CmHB3、CmHB4的表達(dá)量呈極顯著差異。

10 d河套.河套蜜瓜原種生長期的果實(shí)；30 d河套.河套蜜瓜原種成熟期的果實(shí)；10 d M9.M9生長期的果實(shí)；30 d M9.M9成熟期的果實(shí)；不同小寫字母a,b,c,d代表存在顯著性差異；不同大寫字母A,B,C,D代表存在極顯著差異；字母相同則無差異。

10 d Hetao.Hetao melon fruit at growth stage; 30 d Hetao.Hetao melon fruit at ripening stage; 10 d M9.M9 fruit at growth stage; 30 d M9.M9 fruit at ripening stage; There was significant difference between a, b, c, d; There was highly significant difference between A, B, C, D; The same letters means no difference.

圖5 基因表達(dá)差異性分析
Fig.5 Difference analysis of gene expression

3 結(jié)論與討論

果實(shí)成熟的眾多調(diào)控因子中，乙烯被認(rèn)為是最關(guān)鍵的影響因子[16]。果實(shí)成熟時(shí)包括細(xì)胞壁代謝、類胡蘿卜素合成、葉綠素降解、芳香物質(zhì)、糖和有機(jī)酸合成等多個(gè)代謝途徑的相關(guān)基因都受乙烯調(diào)控[17]。乙烯通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控植物體內(nèi)的生理活動(dòng)[18]。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)目標(biāo)基因家族的表達(dá)量檢測(cè)具有成本低、高通量的優(yōu)勢(shì)，是目前挖掘功能基因的主要手段之一[19]。本研究選取在果實(shí)發(fā)育和成熟中已報(bào)道的4個(gè)相關(guān)基因作為目標(biāo)基因，在甜瓜基因組中鑒定獲得其家族成員。對(duì)這些基因在河套蜜瓜原種和M9品系不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)CmETR家族成員在成熟過程的表達(dá)水平在河套蜜瓜原種和M9中都呈下調(diào)趨勢(shì)。Ciardi等[20]發(fā)現(xiàn)乙烯受體在乙烯信號(hào)通路中是通過負(fù)調(diào)控來傳遞信號(hào)的，ETR的表達(dá)水平降低可提升植株對(duì)乙烯的敏感性。此外，CmCTR12基因在果實(shí)發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，且后期呈下調(diào)模式，這與姚遠(yuǎn)等[21]在甜瓜中克隆的Cm-CTR1基因具有相同的表達(dá)模式。

本研究中13個(gè)基因在河套蜜瓜原種的2個(gè)時(shí)期存在顯著差異表達(dá)，12基因在M9的2個(gè)時(shí)期存在顯著差異表達(dá)，其中CmHB3和CmHB11呈下調(diào)表達(dá)模式且不同時(shí)期的表達(dá)量存在極顯著差異，推測(cè)其可能在生長期起作用；而CmHB4呈上調(diào)表達(dá)模式且不同時(shí)期的表達(dá)量存在極顯著差異，推測(cè)其可能在成熟期發(fā)揮作用。在生長期的河套蜜瓜原種和M9中，5個(gè)基因的表達(dá)量存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達(dá)量在不同材料間存在極顯著差異；而在成熟期的河套蜜瓜原種和M9中，4個(gè)基因的表達(dá)量在2個(gè)材料間存在顯著差異，其中CmHB3和CmHB11的表達(dá)量在不同材料間存在極顯著差異，推測(cè)在果實(shí)發(fā)育過程中CmACO1的表達(dá)影響CmHB3和CmHB11的表達(dá)水平。番茄中LeHB1基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致LeACO1基因的表達(dá)也降低[9]，而本研究中發(fā)現(xiàn)CmHB3和CmHB112個(gè)基因在轉(zhuǎn)反義CmACO1基因的材料中的表達(dá)量顯著低于河套蜜瓜原種，暗示甜瓜中CmACO1基因的表達(dá)也影響CmHB基因的表達(dá)水平。另外，CmRIN14和CmRIN15的表達(dá)量在河套蜜瓜原種和M9中存在截然相反的情況，表明其表達(dá)模式受CmACO1表達(dá)水平的影響。