外源GA3和PBZ對(duì)桃枝條生長(zhǎng)及其GA相關(guān)基因表達(dá)的影響

譚 彬，王 婷，郝鵬博，鄭先波，程 鈞，王 偉，馮建燦

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

桃(PrunuspersicaL.)是深受人們喜愛的世界性大宗水果。2016年我國(guó)桃種植面積達(dá)836 500 hm2，總產(chǎn)量1 444萬t，分別占世界總量的51.0%和57.8%，產(chǎn)量和收獲面積均居世界首位[1]。隨著我國(guó)對(duì)桃果需求量的增加及果樹栽培技術(shù)的提高，簡(jiǎn)約化栽培已成為果樹產(chǎn)業(yè)規(guī)范化管理和集約化經(jīng)營(yíng)發(fā)展的一個(gè)新趨勢(shì)。桃矮化品種具有節(jié)間短、早結(jié)果、早豐產(chǎn)、產(chǎn)出果實(shí)品質(zhì)較高和修剪整形技術(shù)容易掌握等眾多優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)是桃的起源中心，桃的遺傳資源種類豐富，生產(chǎn)中通過傳統(tǒng)育種手段已經(jīng)培育出一些矮化品種或類型[2-5]，但這些矮化品種主要以觀賞型為主，花果兼用或果用品種較少。目前生產(chǎn)上桃栽培品種由于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，以至生產(chǎn)中依賴頻繁修剪和施用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)樹體生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控，這些措施費(fèi)工費(fèi)時(shí)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，且容易產(chǎn)生激素殘留等安全方面的問題。劉偉等[6]對(duì)我國(guó)桃主產(chǎn)區(qū)山東省進(jìn)行了桃生產(chǎn)成本分析，結(jié)果表明，桃生產(chǎn)過程中勞動(dòng)力成本占據(jù)生產(chǎn)總成本的53%，其中整形修剪及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的施用占總用工量的至少25%。因此，開展控制桃節(jié)間長(zhǎng)度的分子研究，嘗試?yán)没蚬こ淌侄闻嘤m宜矮化密植的矮化桃品種對(duì)實(shí)現(xiàn)桃簡(jiǎn)約化栽培具有重要意義。

在果樹生產(chǎn)中通過使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)果樹生長(zhǎng)、控制樹勢(shì)、調(diào)控植物的多種生長(zhǎng)發(fā)育過程，目前常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有赤霉素(Gibberellin，GA)和多效唑(Paclobutrazol，PBZ)2種。GA最顯著的作用為促進(jìn)植物莖端和節(jié)間伸長(zhǎng)[7]，當(dāng)其合成受到抑制或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到阻遏都會(huì)引起活性GA水平的改變并最終導(dǎo)致植物的矮化；PBZ主要通過抑制GA生物合成過程中由貝殼杉烯到貝殼杉烯酸氧化過程來抑制GA的生物合成[8]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中通過抑制GA的合成抑制枝條生長(zhǎng)，導(dǎo)致節(jié)間變短。

目前GA的合成代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已研究的較為透徹，相關(guān)基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能相繼被報(bào)道。其中KO(Ent-kaurene oxidase，內(nèi)根貝殼杉烯氧化酶)、GA20-ox(Gibberellin 20-oxidase)和GA3-ox(Gibberellin 3-oxidase)是GA合成途徑中關(guān)鍵的合成酶，現(xiàn)有研究證明，該類氧化酶基因發(fā)生突變功能喪失后均導(dǎo)致植株矮化[9-11]。Itoh等[9]對(duì)1個(gè)水稻半矮化突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其半矮化性狀是由KO基因的突變導(dǎo)致GA合成受抑制而產(chǎn)生；Xu等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥ga5突變體的半矮化是由于AtGA20-ox基因內(nèi)1個(gè)點(diǎn)突變(G/A)導(dǎo)致基因功能改變影響活性GA的產(chǎn)生而形成；Carrera等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源GA3處理馬鈴薯葉片后GA20-ox基因的表達(dá)量明顯被抑制，證明該基因具有明顯的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用；Reinecke等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PsGA3-ox1基因的轉(zhuǎn)基因豌豆節(jié)間明顯伸長(zhǎng)，且活性GA1水平升高。GA2-ox(Gibberellin 2-oxidase)為GA代謝途徑中重要的代謝酶，其參與植物體內(nèi)活性GA的平衡調(diào)節(jié)過程，該基因過表達(dá)后會(huì)引起植株出現(xiàn)矮化表型[15]。

GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基本元件主要由活性GA受體蛋白GID1(Gibberellin insensitive dwarf1)[16]、GA信號(hào)途徑阻遏蛋白DELLA[17]、泛素E3連接酶復(fù)合體(SCFSLY1/GID2)[18]和26S蛋白酶[19]等組成?，F(xiàn)有的研究已明確，植物體內(nèi)的活性GA被受體蛋白GID1感知后與DELLA蛋白互作，形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體促進(jìn)DELLA蛋白的降解；DELLA蛋白功能為抑制植物GA效應(yīng)來抑制植物生長(zhǎng)，是GA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子。Dill等[20]發(fā)現(xiàn),擬南芥DELLA蛋白特征結(jié)構(gòu)域的缺失直接導(dǎo)致了矮化表型的出現(xiàn)，并且在敲除該基因后GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完全被抑制；Li等[21]發(fā)現(xiàn),1株油菜矮化突變體，由于其GID1基因啟動(dòng)子序列發(fā)生突變?cè)斐芍仓陮?duì)活性GA不敏感從而導(dǎo)致矮化性狀的產(chǎn)生。SLY1(SLEEY1)屬于F-box蛋白家族，其與DELLA蛋白互作并介導(dǎo)DELLA蛋白的降解，是GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子，該基因的突變會(huì)引起植株出現(xiàn)矮化表型[22]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)植物乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子ERF類轉(zhuǎn)錄因子，其在GA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也發(fā)揮重要作用。Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)，AtERF11是GA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子，AtERF11基因的過表達(dá)導(dǎo)致活性GA含量升高，且植株表現(xiàn)出明顯的節(jié)間伸長(zhǎng)。

GA合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因在模式植物和大田作物上的研究為該途徑在木本果樹上的研究奠定了基礎(chǔ)。Boss等[24]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄品種莫尼耶皮諾中1個(gè)單堿基的突變導(dǎo)致DELLA特征結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變而產(chǎn)生矮化表型；Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果中過量表達(dá)擬南芥Atgai基因可導(dǎo)致蘋果節(jié)間長(zhǎng)度降低、節(jié)數(shù)減少，表現(xiàn)矮化表型；Hollender等[26]發(fā)現(xiàn)1株桃的矮化突變體，其矮化表型是由PpeGID1c基因的無義突變導(dǎo)致。上述研究為利用GA途徑相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)果樹矮化育種提供了新思路。基于此，選取對(duì)外源GA3和PBZ敏感性適中的黃水蜜桃[27]為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行外源GA3和PBZ處理，研究其在不同處理后新梢生長(zhǎng)變化規(guī)律以及嫩梢組織中GA合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)量的變化，為通過基因工程手段獲得桃矮化新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為黃水蜜桃1年生嫁接苗，于2016年春定植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)，定植時(shí)接穗枝條上留3～4個(gè)芽后剪去上部枝條，萌發(fā)后留下長(zhǎng)勢(shì)較一致芽，抹去其余嫩芽，并進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量及取樣方法

1.2.1 外源GA3和PBZ處理試驗(yàn) 于黃水蜜桃嫩梢長(zhǎng)至10 cm長(zhǎng)時(shí)(4月29日)，對(duì)其進(jìn)行葉面噴施處理，處理1：100 mg/L GA3；處理2：1 500 mg/L PBZ，均以噴施清水作為對(duì)照。每處理隨機(jī)選取3株為一小區(qū)，重復(fù)3次，分別于噴施0，2，5，8，11，14，17 d對(duì)黃水蜜桃新梢長(zhǎng)度及凈生長(zhǎng)量進(jìn)行調(diào)查；并于處理后0 d、2 h、8 h、2 d、5 d、8 d、11 d、14 d和17 d采集嫩梢，采后迅速放入液氮中，之后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.2.2 外源GA3逆轉(zhuǎn)處理試驗(yàn) 通過分析上述PBZ處理后黃水蜜桃嫩梢生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理后17 d時(shí)嫩梢生長(zhǎng)受到較強(qiáng)的抑制，故選取PBZ處理后17 d的黃水蜜桃為試材，噴施100 mg/L GA3進(jìn)行逆轉(zhuǎn)處理，以噴施清水作為對(duì)照。隨機(jī)選取3株為1個(gè)小區(qū)，重復(fù)3次，分別于噴施0，3，6，9，12 d時(shí)對(duì)黃水蜜桃新梢長(zhǎng)度及凈生長(zhǎng)量進(jìn)行調(diào)查；并于處理后0 d、2 h、8 h、3 d、6 d、9 d和12 d采集嫩梢，采后迅速放入液氮中，之后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)基因表達(dá)量測(cè)定。

1.3 GA代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定

黃水蜜桃嫩梢組織總RNA的提取參照柱式植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant total RNA Purification Kit)方法進(jìn)行，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。RNA的濃度及質(zhì)量分別使用分光光度計(jì)NanoDrop 2000(Thermo Scientific)和1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。cDNA的合成參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋至200 ng/μL，用于后續(xù)試驗(yàn)。熒光定量Mix(PrimeScript RT Master Mix)購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。與GA合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因CDS序列從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載，利用Primer 3.0在線工具(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，目的基因及內(nèi)參基因定量引物信息見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成。在ABI Prism 7500 FAST Sequence Detection System(Applied Biosystems，Madrid，CA，USA)上進(jìn)行qRT-PCR分析，以18SrRNA作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照郝鵬博[28]的方法，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Tab. 1 Primers of Real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異顯著性分析，差異顯著性分析檢驗(yàn)方法為t-檢驗(yàn)，P<0.05。利用2-ΔΔCt法分析處理qRT-PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)，使用SigmaPlot 12.5進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GA3和PBZ處理對(duì)黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)及GA合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.1.1 外源GA3和PBZ處理對(duì)黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)的影響 對(duì)黃水蜜桃1年生植株分別噴施GA3和PBZ后，定期對(duì)不同處理新梢生長(zhǎng)量及凈生長(zhǎng)量進(jìn)行觀察測(cè)量，結(jié)果如圖1所示，外源GA3噴施后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)新梢生長(zhǎng)量均高于對(duì)照處理，而PBZ處理后新梢生長(zhǎng)量均低于對(duì)照處理，表明外源GA3對(duì)新梢生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，PBZ對(duì)新梢生長(zhǎng)具有抑制作用。此外，對(duì)比不同處理的新梢凈生長(zhǎng)量，發(fā)現(xiàn)GA3處理后新梢凈生長(zhǎng)量高于對(duì)照，并在GA3處理后8 d時(shí)新梢凈生長(zhǎng)量顯著高于對(duì)照；PBZ處理后新梢凈生長(zhǎng)量低于對(duì)照，其新梢凈生長(zhǎng)量的變化趨勢(shì)與GA3處理一致，但新梢生長(zhǎng)量在PBZ處理后5，8，14 d時(shí)均顯著低于對(duì)照，且在PBZ處理后17 d時(shí)極顯著低于對(duì)照，表明PBZ處理對(duì)新梢生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

2.1.2 外源GA3和PBZ處理對(duì)GA合成代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響 在黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)過程中，對(duì)不同處理GA合成代謝途徑相關(guān)基因在嫩梢組織中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2所示，在外源GA3處理后，與GA合成相關(guān)基因KO和GA3-ox的表達(dá)量呈現(xiàn)出相同的表達(dá)模式，即在處理初期的2 h內(nèi)2個(gè)基因的表達(dá)量均略低于對(duì)照，此后2個(gè)基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，KO基因在處理后17 d時(shí)達(dá)到峰值；而GA20-ox基因的表達(dá)量在處理初期的5 d內(nèi)與對(duì)照類似均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，此后其表達(dá)量逐漸上升，在處理后14 d時(shí)表達(dá)量高于對(duì)照，且在17 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，與對(duì)照相比上調(diào)30倍。在外源PBZ處理后，與GA合成相關(guān)基因KO、GA3-ox和GA20-ox的表達(dá)趨勢(shì)各不相同，其中KO基因在處理初期8 h內(nèi)的表達(dá)量低于對(duì)照，此后表達(dá)量持續(xù)高于對(duì)照，直到處理后8 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，且高于對(duì)照，此后表達(dá)量下降并低于對(duì)照；GA3-ox基因的表達(dá)量在處理初期的8 d內(nèi)均低于對(duì)照，在處理11 d時(shí)達(dá)到峰值，且高于對(duì)照，此后其表達(dá)量急劇下降；GA20-ox的表達(dá)量在處理初期5 d內(nèi)與對(duì)照類似均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，此后表達(dá)量快速升高，在11 d時(shí)達(dá)到峰值，且低于對(duì)照，隨后其表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)下降并在處理后17 d時(shí)低于對(duì)照。

圖1 GA3和PBZ處理后黃水蜜桃新梢的生長(zhǎng)變化Fig.1 Changes of shoot growth after GA3 and PBZ treatments on Huangshuimi

與GA代謝相關(guān)基因GA2-ox的表達(dá)量在不同處理中呈現(xiàn)出相似的表達(dá)趨勢(shì)，在處理前期的8 d內(nèi)2種處理與對(duì)照的GA2-ox基因的表達(dá)量均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，在處理11 d時(shí)GA2-ox基因的表達(dá)量達(dá)到峰值且均高于對(duì)照，此后GA2-ox基因的表達(dá)量在2種處理和對(duì)照中都表現(xiàn)出先下降(14 d)后略微上升(17 d)的趨勢(shì)。

圖2 GA合成代謝途徑相關(guān)基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達(dá)量Fig.2 The expression of genes related to the gibberellin biosynthesis pathway in shoot of Huangshuimi

2.1.3 外源GA3和PBZ處理對(duì)黃水蜜桃GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響 在黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)過程中，對(duì)不同處理GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因在嫩梢組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，在外源GA3處理后，嫩梢中DELLA、GID1c和SLY1基因在處理后8 d內(nèi)與對(duì)照類似，均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，隨后表達(dá)量逐漸升高，在14 d時(shí)達(dá)到峰值，且此時(shí)DELLA、GID1c和SLY1基因的表達(dá)量均高于對(duì)照，此后表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而對(duì)照處理中DELLA、GID1c和SLY1基因的表達(dá)量均在11 d時(shí)達(dá)到峰值，其后表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；ERF11基因在處理2h內(nèi)表達(dá)量高于對(duì)照,隨后下降且趨于不表達(dá)，在處理后8 d時(shí)表達(dá)量逐漸升高并于14 d時(shí)達(dá)到峰值且高于對(duì)照。在外源PBZ處理后，DELLA、GID1c和SLY1基因與對(duì)照呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，均在處理后8 d內(nèi)處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，在處理后11 d時(shí)達(dá)到峰值，且表達(dá)量持續(xù)低于對(duì)照；ERF11基因表達(dá)趨勢(shì)與對(duì)照類似，其表達(dá)量在處理后2,11 d時(shí)出現(xiàn)2個(gè)高峰，且與對(duì)照相比，ERF11基因表達(dá)量始終低于對(duì)照。

圖3 GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達(dá)量Fig.3 The expression of genes related to the GA signaling transduction pathway in shoot of Huangshuimi

2.2 外源GA3處理對(duì)PBZ的逆轉(zhuǎn)過程中黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)及GA合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)

2.2.1 逆轉(zhuǎn)處理過程中黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)變化 對(duì)逆轉(zhuǎn)處理后黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)量的測(cè)量結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過PBZ處理后的黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)量在外源GA3處理后有所增加，且始終高于對(duì)照；GA3逆轉(zhuǎn)處理后新梢凈生長(zhǎng)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)始終高于對(duì)照，且在處理后3,6 d時(shí)均顯著高于對(duì)照。表明外源GA3處理可有效逆轉(zhuǎn)PBZ對(duì)新梢生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)新梢生長(zhǎng)。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)處理對(duì)黃水蜜桃GA合成代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響 對(duì)黃水蜜桃PBZ處理17 d后，通過葉面噴施GA3對(duì)其生長(zhǎng)過程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)處理，對(duì)逆轉(zhuǎn)過程中GA合成代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)水平變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖5所示，在外源GA3處理后，黃水蜜桃嫩梢組織中與GA合成相關(guān)基因KO和GA20-ox的表達(dá)量在處理后8 h內(nèi)均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，隨后其表達(dá)量逐漸上升，并于處理后6 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)KO基因表達(dá)量低于對(duì)照，而GA20-ox基因的表達(dá)量高于對(duì)照，隨后KO和GA20-ox基因的表達(dá)量逐漸下降，并在處理后12 d時(shí)均高于對(duì)照；GA3-ox基因在整個(gè)逆轉(zhuǎn)時(shí)期均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)。與GA代謝相關(guān)基因GA2-ox的表達(dá)量在處理后8 h內(nèi)逐漸升高，并在處理后3 d時(shí)達(dá)到峰值，此后表達(dá)量逐漸下降，而對(duì)照在整個(gè)逆轉(zhuǎn)時(shí)期均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)。

圖4 逆轉(zhuǎn)處理后黃水蜜桃新梢生長(zhǎng)變化Fig.4 Changes of shoot growth after reverse treatment on Huangshuimi

圖5 逆轉(zhuǎn)處理后GA合成代謝途徑中相關(guān)基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達(dá)量Fig.5 The expression of genes related to gibberellin biosynthesis pathway in shoot of Huangshuimi after reverse treatment

2.2.3 逆轉(zhuǎn)處理對(duì)黃水蜜桃GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響 在外源GA3逆轉(zhuǎn)處理后，對(duì)黃水蜜桃嫩梢組織中與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖6所示，GID1c和ERF11基因在處理后8 h內(nèi)處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，隨后表達(dá)量逐漸升高，其表達(dá)量分別在處理后3，6 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量逐漸下降且高于對(duì)照，而對(duì)照處理中GID1c基因在整個(gè)時(shí)期內(nèi)均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)；DELLA和SLY1基因在處理后2 h內(nèi)表達(dá)量處于下降趨勢(shì)，隨后表達(dá)量逐漸上升，DELLA基因表達(dá)量在處理后3 d時(shí)達(dá)到峰值但表達(dá)量低于對(duì)照，而SLY1基因的表達(dá)量在處理初期出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，并于6 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值且表達(dá)量高于對(duì)照，DELLA和SLY1基因達(dá)到峰值后，均逐漸降低并于處理9 d后開始上升，最終表達(dá)量均高于對(duì)照。

圖6 逆轉(zhuǎn)處理后GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達(dá)量Fig.6 The expression of genes related to the GA signaling transduction pathway in shoot of Huangshuimi after reverse treatment

3 結(jié)論與討論

GA是重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其最為顯著的生理作用是促進(jìn)植物的莖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；PBZ作為GA的抑制劑，可使新梢節(jié)間縮短，有效抑制果樹新梢的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。劉芳等[7]于甜櫻桃品種紅燈新梢生長(zhǎng)期分別對(duì)葉面噴施GA3和PP333，結(jié)果表明，GA3可明顯促進(jìn)新梢生長(zhǎng)而PP333顯著抑制新梢生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中對(duì)黃水蜜桃進(jìn)行外源GA3處理，結(jié)果表明，與對(duì)照相比桃嫩梢生長(zhǎng)量增加，并在GA3處理后8 d時(shí)新梢凈生長(zhǎng)量顯著高于對(duì)照；在PBZ處理后新梢凈生長(zhǎng)量低于對(duì)照，其新梢凈生長(zhǎng)量在處理后5，8，14 d時(shí)均顯著低于對(duì)照，并在處理后17 d時(shí)達(dá)極顯著水平。本研究結(jié)果與劉芳等[7]研究結(jié)果相似，GA3和PBZ處理分別對(duì)新梢生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)和抑制作用。Steffens等[29]通過對(duì)蘋果枝條進(jìn)行外源PBZ處理，發(fā)現(xiàn)蘋果枝條生長(zhǎng)受到抑制，節(jié)間長(zhǎng)度變短，繼而噴施GA3后可在短期內(nèi)使枝條恢復(fù)生長(zhǎng)。本研究中在PBZ處理后17 d時(shí)對(duì)黃水蜜桃噴施外源GA3，發(fā)現(xiàn)可明顯解除PBZ對(duì)桃新梢生長(zhǎng)的抑制作用，新梢凈生長(zhǎng)量在處理后3,6 d時(shí)均顯著高于對(duì)照，表明外源GA3處理可有效逆轉(zhuǎn)PBZ對(duì)枝條生長(zhǎng)的抑制作用，該結(jié)果與Steffens等[29]在蘋果試驗(yàn)中結(jié)果一致。

GA合成代謝途徑中關(guān)鍵酶KO、GA20-ox、GA3-ox和GA2-ox對(duì)維持植物體內(nèi)活性GA水平具有重要作用。Carrera等[13]研究發(fā)現(xiàn)，StGA20-ox蛋白在馬鈴薯ga1突變體葉片中高表達(dá)，表明GA20-ox受到植物內(nèi)源活性GA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)；Bidadi等[30]對(duì)擬南芥莖尖分別噴施GA3和GA合成抑制劑Uniconazole，發(fā)現(xiàn)GA3處理導(dǎo)致擬南芥初級(jí)根伸長(zhǎng)不明顯，而Uniconazole處理后初級(jí)根明顯伸長(zhǎng)，且GA20-ox和GA3-ox基因表達(dá)量增加，表明GA合成抑制劑的使用提高了活性GA的含量并啟動(dòng)根的伸長(zhǎng)；Wuddineh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)PvGA2-ox5和PvGA2-ox9基因的轉(zhuǎn)基因柳枝稷(PanicumvirgatumL.)均表現(xiàn)出與GA缺陷型突變體類似的矮化表型，外源噴施GA后表型恢復(fù)。本試驗(yàn)在對(duì)黃水蜜桃進(jìn)行外源GA3處理后，GA合成相關(guān)基因KO和GA3-ox在嫩梢中的表達(dá)量在處理2 h后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)受到抑制作用，而GA20-ox基因在GA處理前期幾乎不表達(dá)，隨著外源GA3藥效減弱，KO和GA20-ox基因表達(dá)量在處理后14 d時(shí)高于對(duì)照，結(jié)合生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，外源GA3處理后GA合成相關(guān)基因參與GA負(fù)反饋調(diào)節(jié)；GA代謝相關(guān)基因GA2-ox表達(dá)量在外源GA3處理后前期近乎不表達(dá)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸升高并高于對(duì)照，表明外源GA3可促進(jìn)GA2-ox基因的表達(dá)，即GA2-ox基因參與活性GA正反饋調(diào)節(jié)。該結(jié)果與GA3對(duì)PBZ逆轉(zhuǎn)處理過程中KO、GA20-ox、GA3-ox和GA2-ox基因表達(dá)量變化類似，且與前人在馬鈴薯[13]、擬南芥[31]中研究結(jié)果一致。上述研究結(jié)果表明，活性GA對(duì)GA合成代謝途徑中合成酶基因表達(dá)水平具有抑制作用，對(duì)GA合成代謝途徑中代謝酶基因表達(dá)水平具有促進(jìn)作用。

GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物中行使作用的機(jī)制為：在植物體內(nèi)活性GA水平較低的情況下，DELLA蛋白抑制GA效應(yīng)來減少植物生長(zhǎng)，而當(dāng)植物體內(nèi)活性GA水平較高時(shí)，GID1蛋白受體通過構(gòu)象變化結(jié)合活性GA，之后與DELLA蛋白形成三聯(lián)體，最后DELLA蛋白被降解，解除對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，開啟活性GA對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[32-33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在外源GA3處理后，嫩梢中DELLA、GID1c和SLY1基因在處理前期與對(duì)照類似均處于近乎不表達(dá)狀態(tài)，隨后表達(dá)量逐漸升高，在14 d時(shí)達(dá)到峰值且均高于對(duì)照；而在外源GA3對(duì)PBZ逆轉(zhuǎn)處理時(shí)期，DELLA蛋白基因和GID1c基因的表達(dá)與初處理中外源GA3處理的表達(dá)趨勢(shì)不一致，即在逆轉(zhuǎn)處理后其表達(dá)量先上升后下降，且在處理后12 d時(shí)DELLA蛋白基因和GID1c基因表達(dá)量均高于對(duì)照，該結(jié)果與Hollender等[26]在矮化桃中GID1c基因的研究結(jié)果相似。SLY1基因是GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子，在外源GA3處理后，該基因在桃嫩梢中表達(dá)量下調(diào)，并于后期迅速上升并高于對(duì)照；而在逆轉(zhuǎn)處理過程中該基因表達(dá)量在處理初期出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，并于6 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值且高于對(duì)照；ERF11基因在外源GA3處理后其表達(dá)量在處理初期高于對(duì)照隨后下降且趨于不表達(dá)，在處理后8 d時(shí)逐漸升高并于14 d時(shí)達(dá)到峰值且高于對(duì)照，進(jìn)一步印證了Zhou等[23]提出的ERF11對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

PBZ是一種植物生長(zhǎng)抑制劑，主要通過抑制植物頂端分生組織中GA的產(chǎn)生，從而抑制GA的生物合成[34]。呂文濤等[35]通過對(duì)朱頂紅品種孔雀花使用不同質(zhì)量濃度PP333處理發(fā)現(xiàn)，300 mg/L PP333處理后可使植株矮化。本試驗(yàn)在對(duì)黃水蜜桃進(jìn)行外源PBZ處理后，與GA合成相關(guān)基因KO、GA20-ox和GA3-ox在嫩梢中的表達(dá)趨勢(shì)各不相同，且在處理后17 d時(shí)表達(dá)量均低于對(duì)照，結(jié)合生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明外源PBZ處理通過下調(diào)桃嫩梢中KO、GA20-ox、GA3-ox基因表達(dá)量調(diào)控枝條生長(zhǎng)量，隨后進(jìn)一步下調(diào)GA合成基因在不同組織中表達(dá)量對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，表明外源PBZ處理可抑制與GA合成相關(guān)基因(KO、GA20-ox和GA3-ox)的表達(dá)；與GA代謝相關(guān)基因GA2-ox在外源PBZ處理后初期與對(duì)照變化趨勢(shì)較為一致，在處理后11 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值且高于對(duì)照，隨著外源PBZ藥效減弱，于處理后17 d時(shí)表達(dá)量略低于對(duì)照，表明外源PBZ處理可抑制GA2-ox基因的表達(dá)；與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因(DELLA、GID1c、SLY1和ERF11)的表達(dá)量表現(xiàn)為在外源PBZ處理后，嫩梢組織在整個(gè)處理時(shí)期的表達(dá)量均低于對(duì)照，受到一定的抑制作用。綜上所述，推測(cè)外源PBZ處理在轉(zhuǎn)錄水平上通過抑制GA途徑中相關(guān)基因表達(dá)水平，從而降低GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效率來行使對(duì)植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用。