玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表達(dá)分析

袁 珍，張鵬鈺,2，王國(guó)瑞，曹麗茹,2,3，庫(kù)麗霞,2，衛(wèi) 麗

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；2.河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450046)

玉米是我國(guó)主要的糧食作物，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭遇干旱等非生物脅迫的影響，造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。胡瑞法等[1]研究表明，限制不同地區(qū)玉米生產(chǎn)發(fā)展的第一因素是干旱(除西南地區(qū)旱地秋玉米外)，干旱嚴(yán)重影響玉米生長(zhǎng),造成產(chǎn)量下降甚至絕產(chǎn)。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化演變過(guò)程中,逐漸形成感受、傳遞干旱信息的系統(tǒng)及一系列生物反應(yīng)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫，從而降低干旱脅迫對(duì)機(jī)體的傷害[2]。植物對(duì)干旱信號(hào)的感知、傳遞及抵御過(guò)程涉及一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。

由蛋白磷酸酶和蛋白激酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)可逆磷酸化在植物逆境信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。蛋白磷酸酶2C (Protein phosphatese 2C，PP2C) 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在生物體中以單體酶的形式存在，其活性依賴于Mg2+或Mn2+[3]。植物中PP2C類蛋白數(shù)量豐富，在PP2C類蛋白的N-或C-末端含有一個(gè)保守的催化結(jié)構(gòu)域，另一端含有一個(gè)復(fù)雜多變的區(qū)域，其結(jié)構(gòu)的多樣性表明PP2C類蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中具有不同的功能[4-6]。諸多研究表明，植物中PP2C類蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的調(diào)控作用，尤其在干旱、高鹽及低溫等環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[4]。Miyazaki等[7]發(fā)現(xiàn)，在冰葉日中花中有10個(gè)PP2C類磷酸酶基因(Mpc1-Mpc10)，其中，干旱脅迫下Mpc5在根中的表達(dá)量上升，高溫脅迫下Mpc8在葉中的表達(dá)量升高。對(duì)煙草Ntpp2c1基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫能強(qiáng)烈而持續(xù)地誘導(dǎo)Ntpp2c1基因表達(dá)；而熱激卻使之表達(dá)水平迅速降低[8]。過(guò)表達(dá)鳶尾IrisPP2C1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥可提高對(duì)ABA的敏感性，暗示IrisPP2C1基因在ABA信號(hào)調(diào)控過(guò)程中起正調(diào)控作用[9]。藜苜蓿中MtPP2C8基因在干旱、低溫、ABA處理下顯著上調(diào)表達(dá)[10]。過(guò)表達(dá)BdPP2CA6基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性提高[11]。干旱、ABA和鹽脅迫可高度誘導(dǎo)水稻PP2C家族A亞族基因OsPP108、MsPP2C的表達(dá)，過(guò)表達(dá)OsPP108、MsPP2C的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性提高[12-13]。谷子PP2C家族A亞族基因都能被ABA誘導(dǎo)表達(dá)，部分基因被PEG、高鹽、低溫和低氮脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[14]。山毛櫸中FsPP2C1/C2基因在ABA信號(hào)途徑中起正調(diào)控作用, 在擬南芥中過(guò)表達(dá)山毛櫸中FsPP2C1/C2基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的抗性[15-16]。而Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫下，ZmPP2C基因的組成型表達(dá)降低了植物在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期間對(duì)干旱和鹽的耐受性，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性。Santiago等[18]報(bào)道，過(guò)表達(dá)PP2Cs家族的HAB1基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性減弱，說(shuō)明PP2C在逆境響應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。FaABI1編碼的蛋白磷酸酶PP2C1負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟[19]。綜上表明，PP2C作為調(diào)節(jié)因子直接或間接參與逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。到目前為止，植物中對(duì)于PP2C的報(bào)道主要集中于擬南芥、水稻等植物[4，20-21]。Schweighofer等[4]報(bào)道了擬南芥中有76個(gè)PP2C基因，Xue等[21]報(bào)道了水稻中有78個(gè)PP2C基因，但其中絕大部分基因的功能還未得到深入的研究。玉米上PP2C基因的克隆及功能驗(yàn)證研究較少[17]，還有很多PP2C基因未被克隆及分析。為此，以抗旱性較強(qiáng)的玉米自交系豫882為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選受干旱誘導(dǎo)強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)的PP2C基因,然后采用同源克隆方法克隆基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析，初步探討PP2C基因在逆境脅迫下的響應(yīng)，為玉米抗逆遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為玉米抗旱自交系豫882，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳彥惠教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

挑選籽粒圓潤(rùn)飽滿、大小較為一致的玉米種子，播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，在自然條件下生長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，對(duì)玉米根、莖、葉分別進(jìn)行取樣，用于基因組織特異性表達(dá)分析。

挑選大小一致的玉米種子，種于用 Hoagland′s營(yíng)養(yǎng)液澆透的營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中(26 ℃/22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、相對(duì)濕度70%)生長(zhǎng)到三葉一心，將其從營(yíng)養(yǎng)缽中連根部營(yíng)養(yǎng)土一起輕輕拔起，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗干凈，然后對(duì)幼苗進(jìn)行以下處理。干旱處理：將玉米幼苗置于含有20% PEG6000的Hoagland′s營(yíng)養(yǎng)液中，于處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h及復(fù)水(R)1，3 d隨機(jī)挑3株玉米幼苗分別取根、葉，將3株樣品等量混和，迅速置液氮中冷凍備用。ABA、NaCl處理：將玉米幼苗分別置于含有100 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl的Hoagland′s營(yíng)養(yǎng)液中，于處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h分別取根、葉，迅速置液氮中冷凍備用。高溫處理：將玉米幼苗置于37 ℃培養(yǎng)箱中，處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h后分別取根、葉迅速置液氮中冷凍備用。以在正常溫室(溫度26 ℃/22 ℃)生長(zhǎng)未進(jìn)行處理的玉米幼苗為對(duì)照。

1.2 20%PEG6000脅迫處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將豫882干旱脅迫處理60，90 h及復(fù)水3 d的材料(以未處理材料為對(duì)照樣品)送廣州基迪奧生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測(cè)序, 獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。采用FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值反映基因的表達(dá)豐度，脅迫處理樣本與對(duì)照樣本基因表達(dá)量差異倍數(shù)以log2(FC)(Fold change)值表示。根據(jù)基因在不同處理時(shí)間后的表達(dá)量, 篩選在脅迫后表達(dá)量明顯上調(diào)、復(fù)水后表達(dá)量明顯下調(diào)的編碼PP2C的基因。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol(Invitrogen,USA)試劑提取樣品RNA，并檢測(cè)其質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA的合成，然后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中ZmPP2C6-01的同源序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物，引物為ZmPP2C6-01F1：5′-ATGGCCGAGATCTGCT GCGA-3′和ZmPP2C6-01R1：5′-TCATATGCCCCG GCGGAGAT-3′，以玉米cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增ZmPP2C6-01的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)。PCR擴(kuò)增體系 (25 μL)，LATaq(5 U/μL)0.2 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL、2×GC Buffer Ⅱ 2 μL、上、下游引物(10 μmmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)挑取陽(yáng)性單克隆，送往北京華大基因有限公司測(cè)序，利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

根據(jù)ZmPP2C6-01基因的測(cè)序結(jié)果，利用 Seqman 軟件對(duì)基因全長(zhǎng)進(jìn)行拼接, 用Editseq 進(jìn)行ORF查詢及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分析；利用Gene Structure Display Server(GSDS 2. 0) (http: //gsds. cbi. pku. edu. cn /index．php) 對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用SOPMA(http://www.expasy.org/tools/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用在線工具Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用Expasy(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)對(duì)蛋白質(zhì)的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用DNAMAN和MEGA 5.1對(duì)不同物種PP2C蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測(cè)ZmPP2C6-01的互作蛋白。

1.6 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)分析

用特異引物ZmPP2C6-01F2:5′-CTAGACTAGTATGGCCGAGATCTGCTGC-3′(劃線部分為SpeⅠ酶切位點(diǎn))和ZmPP2C6-01R2:5′-TTGGCGCGCCATAT GCCCCGGCGGAGAT-3′(劃線部分為AscⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增ZmPP2C6-01基因，用SpeⅠ和AscⅠ雙酶切ZmPP2C6-01產(chǎn)物和表達(dá)載體pMDC83，然后用T4-DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。參照劉兆明等[22]方法，采用熱激法將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，再一次酶切測(cè)序驗(yàn)證正確后，選取培養(yǎng)至四-六葉期健壯的本氏煙，將含陽(yáng)性克隆的農(nóng)桿菌重懸液用1 mL注射器浸染煙葉下表皮，48 h后將注射孔部位的葉片表皮組織制作成臨時(shí)玻片，倒置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察本氏煙表皮細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)情況。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)ZmPP2C6-01全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，前引物為ZmPP2C6-01F3:5′-GCTG TCCGTCGACCACAAG-3′，后引物為ZmPP2C6-01R3:5′-CGCTCCGTCACCGTTACCT-3′。以玉米18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參，其引物為18S1: 5′-CCTGCGGCTTAA TTGACTC-3′，18S2:5′-GTTAGCAGGCTGAGGTCT GG-3′。熒光定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀中進(jìn)行，熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書，PCR體系(20 μL)含：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，正、反向引物(10 μmmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù) 2-ΔΔCt法[23]計(jì)算基因相對(duì)拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)編碼PP2C基因的篩選

通過(guò)GO基因功能注釋結(jié)果篩選到響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)的編碼PP2C的基因8個(gè)，對(duì)20%PEG6000處理樣本和對(duì)照樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析(表1)發(fā)現(xiàn)，除脅迫處理60，96 h的GRMZM2G057907與脅迫處理96 h的 GRMZM2G082487外，其他基因均上調(diào)表達(dá)；在復(fù)水3 d后，8個(gè)編碼PP2C基因的表達(dá)量均低于對(duì)照。其中，GRMZM2G057907、GRMZM2G010298、GRMZM2G108309、GRMZM2G155991均只在1個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到顯著水平；而GRMZM2G059453在60，96 h均達(dá)到顯著水平；GRMZM2G082487在60 h、復(fù)水3 d時(shí)均達(dá)到顯著水平；GRMZM2G134628、GRMZM2G166297在96 h、復(fù)水3 d達(dá)到顯著水平，因GRMZM2G166297在脅迫60，96 h的表達(dá)量及l(fā)og2(FC)值大于GRMZM2G134628，而復(fù)水3 d的 log2(FC)小于GRMZM2G134628，在干旱脅迫下響應(yīng)強(qiáng)烈，整體呈升-升-降的表達(dá)趨勢(shì)。本研究以GRMZM2G166297為對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白為PP2C6，故命名為ZmPP2C6-01。

表1 8個(gè)編碼PP2C基因的差異表達(dá)分析Tab.1 Differential expression analysis of 8 coding PP2C genes

注：不同字母表示差異顯著性(P<0.05)。

Note：Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.2 ZmPP2C6-01基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

以特異引物ZmPP2C6-01F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目的片段為1 242 bp(圖1)，經(jīng)回收純化，連接至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取正確的陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

M.DL2000 DNA Marker；1.cDNA的PCR產(chǎn)物。M.DL2000 DNA Marker;1.PCR product of cDNA.

對(duì)ZmPP2C6-01基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因有4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子，CDS(Coding sequence)全長(zhǎng)為1 242 bp，5′UTR為234 bp，3′UTR為220 bp，共編碼413個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為43.8 ku，等電點(diǎn)為6.6(圖2-A)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，ZmPP2C6-01含43.58%的α-螺旋、12.84%的延伸鏈、5.57%的β-轉(zhuǎn)角和38.01%的不規(guī)則卷曲(圖2-B)，由此可知，ZmPP2C6-01蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。預(yù)測(cè)ZmPP2C6-01 的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2-C)發(fā)現(xiàn)，ZmPP2C6-01蛋白中包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲。對(duì)ZmPP2C6-01氨基酸序列的親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖2-D)發(fā)現(xiàn)，ZmPP2C6-01氨基酸序列中親水性氨基酸所占比例高于疏水性氨基酸，因此，整個(gè)肽鏈表現(xiàn)為親水性，ZmPP2C6-01蛋白為親水性蛋白。

2.3 ZmPP2C6-01 氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)ZmPP2C6-01氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，選擇同源性較高的其他4種植物的PP2C蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析發(fā)現(xiàn)，參比序列均含有一個(gè)非常保守的PP2C蛋白結(jié)構(gòu)域，同時(shí)ZmPP2C6-01的氨基酸序列長(zhǎng)度與其他物種PP2C蛋白序列長(zhǎng)度相近，ZmPP2C6-01氨基酸序列與高粱、玫瑰草、哈氏黍、粟PP2C蛋白氨基酸序列同源性分別達(dá)85%，81%，79%，78%(圖3)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，ZmPP2C6-01與高粱的PP2C蛋白親緣關(guān)系最近，玫瑰草、哈氏黍、粟依次次之；而與冬小麥、粗山羊草等的PP2C蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

A.基因結(jié)構(gòu)分析；B.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C.蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D.蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測(cè)。B中長(zhǎng)豎線區(qū).α螺旋；中豎線區(qū).延伸鏈；次中豎線區(qū).β-轉(zhuǎn)角；短線區(qū).無(wú)規(guī)則卷曲。A.Gene structure analysis; B.Protein secondary structure prediction; C.Protein tertiary structure prediction; D.Protein hydrophilicity/hydrophobicity prediction.B:Long vertical bar area.α-helix; Medium vertical bar area.Extended strand; Sub-medium vertical bar area.β-turn; Short vertical bar area.Random coil.

圖3 ZmPP2C6-01蛋白與多種植物PP2C蛋白的多序列比對(duì)分析Fig.3 Multiple sequence alignment of ZmPP2C6-01 and PP2C proteins from other plants

圖4 ZmPP2C6-01蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ZmPP2C6-01 protein

2.4 ZmPP2C6-01的互作蛋白預(yù)測(cè)

利用在線預(yù)測(cè)與ZmPP2C6-01互作的蛋白發(fā)現(xiàn)(表2)，與ZmPP2C6-01互作系數(shù)較高的編碼相關(guān)蛋白的基因有5個(gè)，分別編碼假設(shè)蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，互作系數(shù)介于0.924～0.973。

2.5 ZmPP2C6-01編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析

煙草下表皮亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖5)表明，在含有對(duì)照載體pMDC83-GFP的煙草細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均發(fā)現(xiàn)了綠色熒光；而對(duì)于含有pMDC83-ZmPP2C6-01-GFP 融合表達(dá)載體的煙草來(lái)說(shuō)，主要在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了綠色熒光，說(shuō)明ZmPP2C6-01定位于細(xì)胞核中。

表2 ZmPP2C6-01互作蛋白分析Tab.2 Analysis of ZmPP2C6-01 interacting protein

圖5 ZmPP2C6-01在煙草表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of ZmPP2C6-01 in tobacco epidermis

2.6 ZmPP2C6-01的表達(dá)分析

2.6.1 組織特異性表達(dá)分析 基因在植物組織中的富集表達(dá)部位與其功能密切相關(guān), 為了研究玉米ZmPP2C6-01基因的功能，對(duì)玉米根、莖、葉中ZmPP2C6-01基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，莖中的表達(dá)水平最弱。其中，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量是莖的7.3倍，是葉的2.3倍，這暗示ZmPP2C6-01基因可能在根中發(fā)揮更重要的作用。

圖6 ZmPP2C6-01基因在玉米不同組織中的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of ZmPP2C6-01 gene in different tissues of maize

2.6.2 脅迫表達(dá)分析

2.6.2.1 20%PEG6000 由圖7可知，在20%PEG6000脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量大部分時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照，脅迫8 h達(dá)到峰值，是對(duì)照的8.8倍，脅迫處理96 h后進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水1～3 d表達(dá)量迅速下降，均低于對(duì)照；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達(dá)量均高于對(duì)照，在脅迫24～84 h表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，于84 h達(dá)到最大值，復(fù)水1～3 d表達(dá)量上升，均高于對(duì)照。

圖7 20% PEG6000脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under 20% PEG6000 stress condition

2.6.2.2 100 μmol/L ABA 100 μmol/L ABA脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量整體上低于對(duì)照(8 h除外)；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達(dá)量均高于對(duì)照，2 h受誘導(dǎo)表達(dá)程度最大，在12～84 h表達(dá)量相對(duì)比較穩(wěn)定，96 h表達(dá)量升高(圖8)。

圖8 ABA脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under ABA stress condition

2.6.2.3 200 mmol/L NaCl 在200 mmol/L NaCl脅迫條件下，玉米幼苗于脅迫處理84 h后死亡。在脅迫處理過(guò)程中，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量在大部分時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照(8,60 h除外)；0～60 h，ZmPP2C6-01基因在葉中的表達(dá)量相對(duì)比較穩(wěn)定，之后表達(dá)量急劇上升，在84 h表達(dá)量最高(圖9)。

圖9 鹽脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under NaCl stress condition

2.6.2.4 高溫 在高溫(37 ℃)脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量整體上低于對(duì)照；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達(dá)量均高于對(duì)照，隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，受誘導(dǎo)表達(dá)程度先降低后逐漸增強(qiáng)，96 h達(dá)到最大(圖10)。

圖10 高溫脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under high temperature stress

3 結(jié)論與討論

本研究從玉米干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組中篩選出8個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的PP2C蛋白基因，通過(guò)基因表達(dá)分析表明，ZmPP2C6-01(GRMZM2G166297)在干旱脅迫下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。利用同源克隆技術(shù)成功克隆了ZmPP2C6-01基因，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因完整的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 242 bp，編碼413個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)含43.58%的α-螺旋、12.84%的延伸鏈、5.57%的β-轉(zhuǎn)角和38.01%的不規(guī)則卷曲，為親水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白與高粱的PP2C蛋白同源性最高，親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ZmPP2C6-01蛋白定位于細(xì)胞核中，這與鄧克勤等[24]的擬南芥PP2C蛋白定位在細(xì)胞核的研究結(jié)果一致。

官曉敏[25]發(fā)現(xiàn)，LjPP2C在百脈根的不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量卻不相同，主要在葉和根中表達(dá)，其次是接種的根瘤菌，在莖中的表達(dá)量低。PdPP2C基因在歐美楊的不同組織中差異表達(dá)，表達(dá)水平表現(xiàn)為根>功能葉>頂端葉>莖[26]。說(shuō)明這些基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因，且功能存在明顯差異。本研究中，ZmPP2C6-01基因的組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在莖中的表達(dá)量最少。說(shuō)明該基因通過(guò)特異的分子表達(dá)機(jī)制參與植物組織的生長(zhǎng)發(fā)育。

本研究結(jié)果表明，ZmPP2C6-01基因在不同非生物脅迫條件下或同一非生物脅迫條件下不同部位中的表達(dá)模式均不一致。胡曉麗[27]對(duì)ZmPP2C2基因進(jìn)行Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗進(jìn)行PEG處理后，該基因在根系中的表達(dá)量明顯強(qiáng)于對(duì)照。顏彥等[28]發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫條件下，二穗短柄草葉中BdPP2C2基因顯著被PEG和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。Liu等[29]報(bào)道，在干旱和鹽處理下，PP2CG1基因在擬南芥的芽中上調(diào)表達(dá)，暗示AtPP2CG1正調(diào)控植物的耐鹽性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達(dá)量大部分時(shí)間點(diǎn)高于對(duì)照，脅迫8 h達(dá)到峰值，同時(shí)在葉中上調(diào)表達(dá)，在脅迫24～84 h表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)總體上逐漸增加，于84 h達(dá)到最大值。在ABA、NaCl、高溫脅迫下，ZmPP2C6-01基因在根中大部分時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于對(duì)照，整體呈下降趨勢(shì)，在葉中的表達(dá)量均高于對(duì)照，呈上調(diào)表達(dá)模式。而王培龍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫下，剛毛檉柳ThPP2C基因在其不同部位及不同處理下差異表達(dá)，在干旱(20%PEG6000)處理后的根中呈下調(diào)表達(dá)模式，而在葉中，脅迫早期差異不明顯，48 h達(dá)到高峰，與ZmPP2C6-01被PEG處理下整體呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)相一致；鹽漬(NaCl)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)處理后，ThPP2C基因在根中均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，而在葉中均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。徐云峰[31]研究發(fā)現(xiàn)，干旱、低溫脅迫均抑制ZmPP2C-A10基因在玉米根系中的表達(dá)，在脅迫處理過(guò)程中該基因表達(dá)水平與脅迫時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；而在復(fù)水階段，該基因表達(dá)量又逐漸恢復(fù)到正常水平。綜上所述，ZmPP2C6-01基因可能參與玉米的抗旱、耐鹽及ABA、高溫應(yīng)答反應(yīng)，但具體調(diào)控途徑不同。在后續(xù)研究中將繼續(xù)對(duì)ZmPP2C6-01基因在玉米抗逆過(guò)程中的具體功能和作用機(jī)制進(jìn)行分析。