p53在低氧調(diào)控人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡中的作用*

王 勤 莊秀妹 何杰玉 張 葉 彭雪珍

牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周韌帶的主要功能細(xì)胞，PDLCs數(shù)量減少與結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致牙周支持組織損傷，誘導(dǎo)或加重牙周組織疾病[1，2]。厭氧菌、咬合創(chuàng)傷、炎癥以及吸煙均可造成牙周微環(huán)境的局部缺血和低氧狀態(tài)，低氧可抑制人PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡[3]。牙周炎患者牙周組織中的低氧標(biāo)志蛋白——低氧誘導(dǎo)因子 -1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)水平相比正常人顯著升高[4]。我們前期研究已證實(shí)，低氧可以通過(guò)激活HIF-1α調(diào)控PDLCs的增殖與凋亡[5]。

p53是關(guān)鍵的腫瘤抑制基因，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，p53在牙周炎組織中升高，并與局部組織的低氧狀態(tài)相關(guān)[7]。然而，p53是否參與低氧抑制PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡？p53與HIF-1α作用關(guān)系如何？這些均不清楚？本研究分析常氧和低氧(1%O2)下PDLCs中p53與HIF-1α表達(dá)，通過(guò)小干擾RNA敲低技術(shù)探討p53在低氧環(huán)境下PDLCs增殖及凋亡的作用。

1.材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FBS、胰酶、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司。小鼠抗人HIF-1α、p53、GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)于Proteintech公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物；其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。常氧組CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2)購(gòu)自Thermo，低氧組CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、1%O2)為英國(guó)New Brunswick生產(chǎn)的GALAXY 48R型號(hào)CO2培養(yǎng)箱。

1.2 PDLCs的原代培養(yǎng) 選擇15～22歲患者因正畸需要拔出的前磨牙，拔出時(shí)牙根完整，且無(wú)牙周、牙體、牙髓、根尖病變，取得患者知情同意。具體方法如下：去除根端血跡，刮取根中1/3牙周膜組織，采用組織塊法以含20%胎牛血清(FBS)、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基原代培養(yǎng)PDLCs。約第6天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%，胰酶消化傳代，后繼續(xù)在含10%FBS、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，前5代PDLCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)細(xì)胞活性檢測(cè) 將5×103個(gè)PDLCs接種于96孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組分別于常氧或低氧培養(yǎng)，加入20μL/孔MTT溶液繼續(xù)孵育4h，去除培養(yǎng)液，加入150μL/孔DMSO后低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)低氧及siRNA處理后PDLCs上清液及細(xì)胞，PBS洗2次，用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106-7個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液，加入5μL Annexin V-APC后避光孵育15 min，再加入10μL PI，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Western免疫印跡 按分組收集PDLCs裂解蛋白進(jìn)行抽提并定量。取等量總蛋白沸水中煮7min，8%SDS-PAGE電泳分離后，將凝膠上蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉2h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影掃描。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR 收集的細(xì)胞用Trizol裂解，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA含量。取 1μg RNA合成 cDNA，按 Takara公司Quant SYBR Green PCR kit試劑操作說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，HIF-1α引物序列為：Forward 5’-GTGCCACATCATCACCATA-3’，Reverse 5’-CAAAGCGACAGATAACACG-3’；p53 引物序列為：Forward 5’-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3’，Reverse 5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；內(nèi)參GAPDH序列為：Forw ard 5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，Reverse 5’-CTGGACTGGACGGCAGATCT-3’。按公式計(jì)算求得各樣品基因相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組基因相對(duì)表達(dá)量為1。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HIF1α-siRNA、p53、NC-siRNA均購(gòu)自上海吉瑪生物科技公司，HIF1α-Si1 靶序列為 5’-CTGATGACCAGCA ACTTGA-3’，HIF1α-Si2 靶序列為：5’-GGAAATGAGAGA AATGCTTAC-3’，p53-Si1 靶序列為5’-CCACUΜGAΜGGAGAGUAUU-3’，p53-Si2靶序列為：5’-TGCGTGTGGAGTATTTGGAT-3’，NC-siRNA 靶序列為：5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根據(jù)說(shuō)明在六孔板中使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染 PDLCs，并設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA為NC-Si組，終濃度為50nM，培養(yǎng)48h，提取蛋白、RNA并進(jìn)行后續(xù)研究。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以表示。各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS13.0軟件包分析結(jié)果。對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正t檢驗(yàn)，若P＜0.05則差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 低氧促進(jìn)PDLCs中p53表達(dá) 在本研究中，Western免疫印跡證實(shí)低氧培養(yǎng)48h后PDLCs的HIF-1α相較常氧組顯著上調(diào)(灰度值：常氧組(56.65±4.35)；低氧組(101.63±10.98)；t=3.888，P=0.018)，與此同時(shí)，低氧組PDLCs的p53表達(dá)也明顯升高(灰度值：常氧組(81.36±10.93)；低氧組(142.52±7.784)；t＝4.561，P=0.011)；此外，實(shí)時(shí)定量PCR也在mRNA水平進(jìn)一步證實(shí)低氧狀態(tài)下PDLCs中HIF-1α表達(dá)上升3.89倍(t=6.260，P=0.003)，p53表達(dá)上升3.07倍(t=6.963，P=0.002)(圖 1)。

圖1 低氧培養(yǎng)48h后PDLCs中HIF-1α與p53蛋白和mRNA水平變化(*：P＜0.05)

2.2 敲低HIF-1α可下調(diào)低氧下PDLCs中p53表達(dá) w estern免疫印跡證實(shí)PDLCs中HIF1α-Si1、Si2轉(zhuǎn)染組相比NC-Si陰性組中HIF-1α分別下降 51.86%(t=4.747，P=0.009)與 53.81%(t=5.355，P=0.006)，而 p53表達(dá)分別下降28.54%(t=2.849，P=0.046)與 34.01%(t=3.105，P=0.036)(圖 2)。

2.3 敲低p53不影響低氧下PDLCs中HIF-1α表達(dá) 為進(jìn)一步探討p53是否為HIF-1α的下游因子，PDLCs轉(zhuǎn)染p53-siRNA，w estern免疫印跡證實(shí)PDLCs中p53-Si1、Si2組相比NC-Si陰性組中p53表達(dá)分別下降66.52%(t=10.69，P=0.0004)與 71.84%(t=10.79，P=0.0004)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；然而，HIF-1α表達(dá)均無(wú)明顯變化(t-Si1=0.1793，P=0.866；t-Si2=0.4364，P=0.685)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

圖2 敲低HIF-1α后低氧下PDLCs中HIF-1α與p53蛋白水平變化(*：P＜0.05，與NC-Si組比較)

圖3 敲低p53后低氧下PDLCs中HIF-1α與p53蛋白水平變化(*：P＜0.05)

2.4 敲低p53促進(jìn)PDLCs增殖 將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在低氧下培養(yǎng)48h，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53-Si1、Si2組PDLCs吸光度值較NC-Si組分別升高2.04倍(t=5.138，P=0.0068)與 1.87 倍(t=4.112，P=0.0147)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 敲低p53后低氧對(duì)PDLCs細(xì)胞活性的影響(*：P＜ 0.05)

2.5敲低p53后可抑制PDLCs凋亡 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在低氧下培養(yǎng)48h后，p53-Si1、Si2組PDLCs凋亡細(xì)胞數(shù)目比NC-Si組分別減少57.53%(t=12.58，P=0.0002)與54.72%(t=9.798，P=0.0006)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 5)。

圖5 敲低p53后低氧對(duì)PDLCs細(xì)胞凋亡的影響(*：P＜ 0.05)

3.討論

PDLCs是牙周組織中含量最豐富的間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)牙周組織的形成與再生有重要影響。慢性牙周炎組織中毒性物質(zhì)堆積、毛細(xì)血管供血不足，造成牙周微環(huán)境中局部低氧狀態(tài)[9，10]。一般情況下，低氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子上升、同時(shí)進(jìn)行無(wú)氧代謝，可增加局部氧供給并降低氧消耗，產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)[11，12]。然而，持續(xù)性低氧可導(dǎo)致PDLCs數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)破壞，引起牙周組織損傷，誘導(dǎo)或加重牙周組織疾病[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者的牙周組織中低氧標(biāo)志蛋白——HIF-1α較正常人顯著升高，提示低氧局部牙周微環(huán)境可能與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。我們前期研究已證實(shí)，低氧可以通過(guò)激活HIF-1α 調(diào)控 PDLCs的增殖和凋亡[5，14]。Song 等[3]通過(guò)鐵螯合劑氯化鈷阻斷氧信號(hào)傳遞，建立低氧模型，證實(shí)氯化鈷化學(xué)建立的低氧環(huán)境可抑制人PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡。我們前期研究直接通過(guò)低氧培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)PDLC在低氧下培養(yǎng)48h、72h時(shí)細(xì)胞增殖活力下降、凋亡增加，隨著低氧處理時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，進(jìn)一步提示了長(zhǎng)時(shí)間低氧環(huán)境是慢性牙周炎發(fā)展的重要原因。此外，低氧促進(jìn)PDLC中HIF-1α的表達(dá)上升，小干擾RNA敲低HIF-1α可逆轉(zhuǎn)低氧抑制PDLCs增殖與促進(jìn)其凋亡，說(shuō)明低氧通過(guò)HIF-1α 對(duì) PDLCs的增殖和凋亡起作用[5，14]。

p53是關(guān)鍵的腫瘤抑制基因，其編碼的p53蛋白主要分布于細(xì)胞核漿，與DNA特異結(jié)合，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化以及泛素化等翻譯后修飾調(diào)控。p53好似“基因組衛(wèi)士”，在G1期檢查DNA損傷點(diǎn)，監(jiān)視基因組的完整性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。研究證實(shí)，p53在牙周炎組織中升高，并與局部組織的低氧狀態(tài)相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDLCs在低氧培養(yǎng)后p53協(xié)同HIF-1α一起表達(dá)升高，通過(guò)小干擾RNA敲低HIF-1α后發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)也隨之降低，提示p53可能是受低氧與HIF-1α調(diào)控表達(dá)；進(jìn)一步敲低p53表達(dá)發(fā)現(xiàn)HIF-1水平無(wú)明顯變化，再次說(shuō)明p53可能是HIF-1α的下游基因。此外，敲低PDLCs中p53表達(dá)后，低氧環(huán)境中PDLCs的增殖能力增強(qiáng)、凋亡比例降低，進(jìn)一步說(shuō)明p53是低氧抑制PDLCs增殖、促進(jìn)其凋亡的重要節(jié)點(diǎn)，并受HIF-1α調(diào)控。還研究發(fā)現(xiàn)，低氧可通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)BNIP與mTOR表達(dá)，促進(jìn)PDLCs發(fā)生自吞噬與凋亡[3]。因此，p53與HIF-1α介導(dǎo)低氧促PDLCs凋亡與牙周炎進(jìn)展的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

綜上，本研究在PDLCs中證實(shí)低氧能通過(guò)上調(diào)p53抑制PDLCs增殖并促進(jìn)其凋亡，并且p53受HIF-1α調(diào)控。低氧是促進(jìn)牙周炎發(fā)生與發(fā)展的重要因素，靶向降低PDLCs中HIF-1α和p53表達(dá)可能是防治牙周炎的研究重點(diǎn)。