富血小板血漿宮腔灌注治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進(jìn)展

任軍香，韓紅敬

(北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100044)

薄型子宮內(nèi)膜的定義尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，臨床上推薦當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度<7 mm時(shí)稱為薄型子宮內(nèi)膜。而頑固性薄型子宮內(nèi)膜定義為至少1次在胚胎移植(ET)周期中經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)激素替代療法(HRT)內(nèi)膜準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm[1]。體外受精-胚胎移植患者(IVF-ET)中薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生率為2.4%[2]。子宮內(nèi)膜厚度<7 mm的患者IVF臨床妊娠率為11%[3]，遠(yuǎn)低于目前平均水平(30%～40%)，并與較高的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[4]。薄型子宮內(nèi)膜人群胚胎植入率低可能與子宮內(nèi)膜血供較少、維持內(nèi)膜正常形態(tài)的蛋白缺乏、支持細(xì)胞脆性增加致妊娠囊失去物理支撐而剝離等有關(guān)。患者體內(nèi)低雌激素水平、先天的子宮畸形、既往宮腔操作史、盆腔感染引發(fā)的子宮內(nèi)膜炎、長(zhǎng)期服用避孕藥、長(zhǎng)期不良生活習(xí)慣等均可導(dǎo)致薄型子宮內(nèi)膜。目前臨床上常用大劑量雌激素補(bǔ)充，聯(lián)合低劑量阿司匹林、維生素E、血管活性藥物(如西地那非)、細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)以及神經(jīng)肌肉刺激等[5]方法改善子宮內(nèi)膜厚度及血流，但仍有部分頑固性子宮內(nèi)膜薄型患者對(duì)以上方案不敏感。頑固性薄型子宮內(nèi)膜的治療是臨床工作中亟待解決的問(wèn)題。

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)被定義為“血小板濃度是正常水平的4～5倍的自體血液中的血漿成分”。PRP為自體外周靜脈血離心提取獲得。20世紀(jì)70年代即已開展了PRP應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)中的研究，目前已廣泛應(yīng)用：骨科在磨碎的骨移植物中添加PRP以提高成骨速率；整形外科在創(chuàng)傷性瘢痕修復(fù)、生發(fā)、游離皮片移植中的應(yīng)用；皮膚科脫發(fā)、難愈性傷口的治療等。PRP的醫(yī)療價(jià)值與生物安全性得到了臨床的認(rèn)可與驗(yàn)證，但其在婦產(chǎn)科的應(yīng)用仍在起步階段，自2015年起PRP改善薄型子宮內(nèi)膜患者的臨床妊娠結(jié)局方面的研究開始出現(xiàn)。目前大部分研究結(jié)果顯示PRP可改善薄型子宮內(nèi)膜的妊娠結(jié)局，小部分研究結(jié)果提示PRP改善薄型子宮內(nèi)膜的作用不明顯。本文對(duì)此方向的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期促進(jìn)研究者對(duì)薄型子宮內(nèi)膜宮腔灌注PRP開展高質(zhì)量研究，并推動(dòng)薄型子宮內(nèi)膜患者PRP宮腔灌注的臨床應(yīng)用。

一、PRP的制備及優(yōu)勢(shì)

Marx[6]將PRP中血小板的有效濃度定義為1×106/μl。通過(guò)提取血液制品成分促進(jìn)組織再生和修復(fù)已有40余年的歷史，PRP的制備也經(jīng)歷了一代和二代。其中二代PRP的制備較一代在功效和性價(jià)比方面有了質(zhì)的提升。但目前臨床制備PRP的方式參差不齊[7]，有待統(tǒng)一。也有研究者認(rèn)為盲目采用文獻(xiàn)中報(bào)道的離心方法是不可取的，需制定與具體的儀器設(shè)備相配套的制備方法[8]。

(一)PRP的制備方法

1.一代PRP的制備：在預(yù)裝有檸檬酸鹽抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取一定量新鮮采集的外周靜脈血，通過(guò)離心去除血液的某些成分來(lái)增加血漿中血小板的濃度。添加血小板激活劑使血小板中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在凝血后10 min內(nèi)激活并釋放，這些因子協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、附著、增殖/分化以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積累的作用。全血采集量需根據(jù)所需PRP用量及患者基礎(chǔ)血小板濃度來(lái)評(píng)估。1 ml PRP的制備需要的全血量大約為5～10 ml，甚至更多[9]，一般宮腔灌注PRP課題需要制備5 ml左右。不同文獻(xiàn)中PRP的制備方法也不盡相同，包括離心速度、離心時(shí)間及離心次數(shù)的差異，主要影響PRP中不同成分的含量，從而影響PRP的功能。因此需要統(tǒng)一PRP的制備方法才能縮小因制備方法不同引起的對(duì)妊娠結(jié)局影響的誤差。

2.二代PRP的制備：以Choukroun離心方法[10]為標(biāo)準(zhǔn)，將采集的靜脈全血以2 700 r/min，離心12 min(亦有3 000 r/min離心10 min)的方式離心后分3層，上層為血小板貧乏的血漿(PPP)，中層為二代PRP，下層為紅細(xì)胞層。制備過(guò)程中應(yīng)注意采血后立即離心；制備完成后立即進(jìn)行宮腔灌注，其生物活性更高。

二代PRP又稱有白細(xì)胞的富血小板纖維蛋白(L-PRF)，它與一代PRP的不同點(diǎn)在于所含細(xì)胞成分比例及纖維蛋白構(gòu)架不同。在離心的過(guò)程中離心速度越快則形成的纖維蛋白網(wǎng)越致密有序。二代PRP僅一次離心，一代PRP需要經(jīng)過(guò)兩次較二代PRP速度低的離心，且第一次離心后會(huì)棄掉上層部分纖維蛋白原。因此二代PRP相較于一代有以下優(yōu)勢(shì)：(1)能發(fā)揮更高的生物學(xué)效應(yīng)。其內(nèi)含白細(xì)胞及其他一些細(xì)胞因子能提高子宮內(nèi)膜的抗感染及修復(fù)能力；(2)不需要額外添加鈣離子等促凝劑，僅一次離心，更方便省力且安全；(3)所含纖維蛋白原更豐富，形成的纖維蛋白網(wǎng)更堅(jiān)固致密、不易被水解，發(fā)揮作用時(shí)間更久[11]。

(二)PRP的優(yōu)勢(shì)

PRP富含多種生長(zhǎng)因子，經(jīng)激活后可以緩慢釋放、協(xié)同發(fā)揮作用，和單一的一次性釋放方式相比作用時(shí)間更長(zhǎng)、具有更強(qiáng)的實(shí)際效果。同時(shí)，相關(guān)研究表明PRP不會(huì)造成細(xì)胞行為方式的改變，即不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性變[12]，而且造成宮腔內(nèi)感染的可能性也極低。此外，PRP來(lái)源于患者本身，減少了宮腔組織對(duì)因子的排斥作用；更容易獲得且成本更低；PRP雖屬于血液制品，但血液傳播疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)非常低。

二、 PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進(jìn)展

(一)PRP作用于子宮內(nèi)膜的機(jī)制及基礎(chǔ)研究進(jìn)展

PRP宮腔灌注的生物學(xué)效應(yīng)可能與PRP中生長(zhǎng)因子的促炎、趨化、促血管生成和抗凋亡作用有關(guān)。PRP中血小板濃度及各種生長(zhǎng)因子如血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等[13]的濃度提升了4～5倍。這些因子在白細(xì)胞向損傷部位的募集、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)其他參與組織修復(fù)的細(xì)胞類型(如平滑肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞)的增殖和遷移、促進(jìn)血管生成以及成纖維細(xì)胞的激活等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。這些生長(zhǎng)因子在PRP被激活的過(guò)程中通過(guò)脫顆粒的方式緩慢釋放，活化的細(xì)胞因子與內(nèi)膜細(xì)胞上相應(yīng)受體作用激活相關(guān)信號(hào)通路，可促進(jìn)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、增殖和分化[15]，從而刺激腺體細(xì)胞及血管的增生，促進(jìn)合成膠原蛋白原，修復(fù)損傷組織。除生長(zhǎng)因子外，PRP中還含有纖維蛋白、纖維結(jié)合蛋白等蛋白質(zhì)物質(zhì)，形成纖維網(wǎng)絡(luò)，起到修復(fù)細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞黏附、防止細(xì)胞流失的支架作用[16]。

2018年一項(xiàng)PRP刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞再生的體外試驗(yàn)進(jìn)一步探討了PRP和PPP對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞(ESF)、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和Ishikawa細(xì)胞(IC)增殖、遷移和基因表達(dá)的影響[15]，該研究發(fā)現(xiàn)：活化的富血小板血漿(APRP)、非活化的富血小板血漿(NAPRP)、PPP均有促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和遷移的作用，但APRP的影響最大且作用最一致。另外，由于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中性激素受體的存在及其細(xì)胞外基質(zhì)重塑的能力，MSCs是細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管生成、細(xì)胞間通訊和絕經(jīng)后組織修復(fù)的重要細(xì)胞成分。MSCs自噬水平降低被認(rèn)為是BM-MSCs老化的機(jī)制之一。在此基礎(chǔ)上，Vishnyakova等[17]通過(guò)自體PRP與自體普通血漿和完全生長(zhǎng)液對(duì)從子宮分離得到的MSCs的影響試驗(yàn)，觀察到PRP處理后子宮內(nèi)膜MSCs中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B蛋白的表達(dá)增加，提示PRP可通過(guò)促進(jìn)自噬從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的自我更新。

楊耀等[18]在衍生的PRP對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞體外增殖影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，37～41周新生兒臍靜脈血中血小板內(nèi)因子PDGF-AB的含量高于同孕周孕婦外周靜脈血中PDGF-AB的含量，此研究還顯示低濃度的PRP可呈劑量依賴模式刺激細(xì)胞的增殖和遷移，超過(guò)一定濃度范圍則抑制細(xì)胞增殖，且2% PRP劑量時(shí)細(xì)胞增殖最強(qiáng)[19]。因此，PRP的劑量濃度與其臨床療效密切相關(guān)，提示找到最適宜宮腔灌注的PRP應(yīng)用濃度臨床意義重大。

(二)PRP作用于子宮內(nèi)膜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型(無(wú)水乙醇處理大鼠宮腔)內(nèi)膜表面平整、腺體及血管不可見，內(nèi)膜功能層菲薄幾近消失[20]。研究表明，將PRP灌注于經(jīng)無(wú)水乙醇處理的大鼠宮腔中，既可提高標(biāo)志子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)蛋白，如波形蛋白(vimentin)、整合素β3、VEGF、同源盒基因-A10(HOXA10)以及細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白Ki-67的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接納能力[20]；又可降低促炎癥細(xì)胞因子IL-1 mRNA的表達(dá)水平，降低炎癥反應(yīng)[21]；還可提高子宮內(nèi)膜波形蛋白的表達(dá)，維持子宮內(nèi)膜細(xì)胞骨架的完整性[20]。經(jīng)PRP宮腔灌注后大鼠宮腔內(nèi)膜表面呈波浪型，可見腺體及小動(dòng)脈增生。子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致腺上皮生長(zhǎng)不良、子宮血流阻力高、血管生成不良，而PRP可促進(jìn)子宮內(nèi)膜損傷后子宮內(nèi)膜腺體及血管的恢復(fù)，減少子宮內(nèi)膜損傷后纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜纖維化的形成[22]。

(三)PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的臨床研究進(jìn)展

Chang等[23]在2015年最先開展宮腔灌注PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究，納入5例既往子宮內(nèi)膜反應(yīng)差、應(yīng)用HRT周期后子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm的患者，于HRT周期的第10日進(jìn)行PRP宮腔灌注，若72 h后子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm則進(jìn)行第2次灌注。結(jié)果5名患者子宮內(nèi)膜厚度均增加，最終4名患者正常妊娠，1名因胚胎染色體異常流產(chǎn)。該研究為PRP改善薄型子宮內(nèi)膜厚度方向的研究拉開了帷幕，也用實(shí)踐第一次證明了PRP宮腔灌注體內(nèi)試驗(yàn)的安全性。

有研究者比較了PRP和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注對(duì)內(nèi)膜薄且反復(fù)種植失敗(RIF)人群凍融胚胎移植(FET)周期妊娠結(jié)局影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法在胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率方面無(wú)顯著差異，改善作用相似[24]，但該研究樣本量較小，仍有待高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照研究驗(yàn)證。另有研究在以上基礎(chǔ)上增加了生理鹽水宮腔灌注組，結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，PRP及G-CSF宮腔灌注均促進(jìn)薄型子宮內(nèi)膜厚度增加及血流改善，但三者之間胚胎種植率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率均未見明顯差異[25]。目前也有研究關(guān)注PRP宮腔灌注治療RIF人群的效果，認(rèn)為宮腔自體PRP輸注是一種安全、廉價(jià)的優(yōu)化子宮內(nèi)膜的輔助治療，特別是對(duì)于有RIF病史的患者。因此RIF或頑固性薄型子宮內(nèi)膜患者是PRP宮腔灌注的重點(diǎn)適用人群。目前大部分的臨床研究得出積極結(jié)論，即宮腔灌注PRP能改善薄型子宮內(nèi)膜人群的妊娠結(jié)局。成慧等[26]設(shè)計(jì)的前瞻性研究顯示，F(xiàn)ET周期中子宮內(nèi)膜對(duì)HRT反應(yīng)不良(周期第13天時(shí)子宮內(nèi)膜厚度<7 mm)的女性，在FET周期的第13天將1 ml PRP注入子宮腔，如48 h后子宮內(nèi)膜厚度未能增加，則在同一周期中重復(fù)PRP灌注；對(duì)照組僅接受HRT。與未進(jìn)行宮腔灌注PRP的對(duì)照組相比，PRP組的子宮內(nèi)膜厚度顯著增加 [(8.76±0.65) mm vs.(8.04±0.41) mm，P=0.001]，胚胎植入率(21.0% vs. 9.37%)和臨床妊娠率(40.5% vs. 20.0%)也顯著增高。另一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究[27]結(jié)果表明，在HRT周期第10天和黃體酮給藥日分別經(jīng)宮腔導(dǎo)管注入PRP，能有效改善子宮內(nèi)膜厚度[(7.65±0.22) mm vs.(6.52±0.31) mm]、提高臨床妊娠率(44.12% vs. 20%)和胚胎植入率(27.94% vs. 11.67%)、降低周期取消率(19.05% vs. 41.18%)，以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此兩項(xiàng)研究代表了目前主流的PRP宮腔灌注時(shí)機(jī)，雖然PRP宮腔灌注的時(shí)機(jī)稍有差異，但均間隔2～5 d予PRP宮腔灌注，且均得出子宮內(nèi)膜增厚、臨床妊娠率提高的結(jié)論。另一項(xiàng)納入83例患者的前瞻性研究認(rèn)為PRP組的胚胎植入率和單周期臨床妊娠率均顯著高于對(duì)照組[28]。齊改梅等[29]的回顧性研究也得出相似的結(jié)論。關(guān)于PRP宮腔灌注的時(shí)機(jī)、重復(fù)PRP宮腔灌注是否優(yōu)于單次灌注、2次PRP宮腔灌注最佳時(shí)間間隔等問(wèn)題，仍有待進(jìn)一步的研究加以闡明并進(jìn)行驗(yàn)證。

Coksuer等[30]回顧性研究觀察到，34例內(nèi)膜形態(tài)不良的RIF患者給予PRP宮腔灌注治療，內(nèi)膜厚度增加(10 mm vs. 6.25 mm，P<0.001)；與36例內(nèi)膜形態(tài)良好不需PRP宮腔灌注的患者相比，臨床妊娠率(35.2% vs. 22.2%)和活產(chǎn)率(41.2% vs. 16.7%)均顯著提高(P<0.05)，而兩組間FET后的自然流產(chǎn)率和異位妊娠率相似。此項(xiàng)研究中PRP宮腔灌注不僅彌補(bǔ)了子宮內(nèi)膜厚度的差異，提高了臨床妊娠率，甚至還提高了活產(chǎn)率，可能與血小板中釋放的多種細(xì)胞因子協(xié)同作用提高了子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)?；町a(chǎn)率的提高是最終體現(xiàn)治療有效性的指標(biāo)，目前尚缺乏PRP宮腔灌注治療薄型子宮內(nèi)膜對(duì)活產(chǎn)率影響的研究。

三、未來(lái)展望

綜上所述，盡管宮腔灌注PRP改善薄型子宮內(nèi)膜厚度以及改善臨床妊娠結(jié)局方面取得了一定的療效，但依舊存在很多的問(wèn)題。例如PRP的制備標(biāo)準(zhǔn)、注射劑量、評(píng)價(jià)指標(biāo)仍存在很大差異，尚無(wú)一致標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)化的PRP制備方案對(duì)于未來(lái)的研究中重現(xiàn)一致和準(zhǔn)確的結(jié)果至關(guān)重要。此外，基礎(chǔ)研究證明了PRP在修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的作用機(jī)制且發(fā)現(xiàn)作用效果與PRP的劑量濃度有關(guān)，但PRP在宮腔中作用的半衰期尚無(wú)文獻(xiàn)說(shuō)明。臨床中部分患者進(jìn)行一次宮腔灌注后子宮內(nèi)膜厚度改善仍不理想者需第二次宮腔灌注，其中兩次灌注的時(shí)間間隔對(duì)于子宮內(nèi)膜厚度的影響仍有待闡明。因此研究PRP的濃度梯度、宮腔灌注的次數(shù)與時(shí)間間隔對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的影響有利于完善PRP宮腔灌注的臨床應(yīng)用。目前大部分的臨床研究樣本較小，某些對(duì)照變量未控制，且隨訪時(shí)間短，僅獲取臨床妊娠率，未隨訪活產(chǎn)率，因此對(duì)母兒最終妊娠結(jié)局的有效性、安全性及不良影響缺乏有力證據(jù)，最終導(dǎo)致臨床研究的證據(jù)級(jí)別較低。因此高質(zhì)量、設(shè)計(jì)完善的隨機(jī)對(duì)照研究、體外試驗(yàn)研究仍有待進(jìn)一步補(bǔ)充完善，為臨床應(yīng)用PRP宮腔灌注治療頑固性薄型子宮內(nèi)膜提供更高質(zhì)量的證據(jù)。