美洲大蠊中蛋白質(zhì)和糖胺聚糖雙指標(biāo)的提取工藝研究

李佳懌，米士麗，張 瑞，陶 然，毛近隆

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)屬昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科，在《本草綱目》記載“蜚蠊，行夜，蛗螽三種，西南夷皆食之?！薄渡褶r(nóng)本草經(jīng)》，其性寒味咸，有小毒，具有散瘀，化積，解毒，通利血脈之功效[1]。美洲大蠊的藥用價(jià)值非常豐富，目前報(bào)道較多有蛋白質(zhì)和多糖類成分，某些蛋白質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等作用，在多糖中的糖胺聚糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂等作用[2-3]，蛋白質(zhì)與多糖在美洲大蠊體內(nèi)常以共價(jià)結(jié)合的方式存在[4-6]，在生物藥物研發(fā)中日益受到人們青睞。

目前美洲大蠊中活性成分的提取研究，對蛋白質(zhì)和多糖有少量文獻(xiàn)報(bào)道，但對糖胺聚糖尚未見到文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)將美洲大蠊通過水提酶解法提取，總蛋白質(zhì)通過改良lowry法測定，糖胺聚糖通過阿利新藍(lán)染色法測定，以總蛋白質(zhì)及糖胺聚糖提取率為雙指標(biāo)，考查提取料液比、時(shí)間和溫度等因素，篩選最佳提取條件，為美洲大蠊進(jìn)一步加工炮制和藥理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

美洲大蠊為臨沂采購，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民教授鑒定為正品；胰蛋白酶、硫酸軟骨素、阿利新藍(lán)、硫酸、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器

HW1型電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；ST-16R 高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；FA1004N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

將美洲大蠊清洗、勻漿、冷凍干燥、粉碎、過40目篩備用。精密稱取美洲大蠊粉6份，每份1.0000 g，分別加入到100 mL具塞錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，超聲提取20 min，超聲溫度為50 ℃，加入胰蛋白酶2000 U(酶活力50000 U/g)，調(diào)節(jié)pH值為8，在37 ℃下酶解3 h[7]，每小時(shí)調(diào)一次pH值，并在一定溫度和超聲時(shí)間下進(jìn)行超聲提取，提取液在3000 r/min離心10 min，將上清液抽濾，并定容到100 mL容量瓶中，得到美洲大蠊的供試品溶液[8-10]。

2.2 總蛋白和糖胺聚糖的測定

2.2.1 總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻(xiàn)方法[11]，采用改良lowry法測定總蛋白的含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.3305X+0.0084，相關(guān)系數(shù)r=0.9986，表明牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在吸光度線性范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

2.2.2 糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻(xiàn)方法[12]，采用阿利新藍(lán)染色法測定糖胺聚糖的含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，硫酸軟骨素濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.1345X+0.0038，相關(guān)系數(shù)r=0.9983，表明硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)溶液在吸光度線性范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

2.2.3 提取率的計(jì)算

取步驟“2.1”所得供試品溶液，按照測定上述方法測定吸光度，計(jì)算總蛋白和糖胺聚糖的含量，總蛋白或糖胺聚糖的提取率為吸光度測定含量與美洲大蠊總質(zhì)量之比。

總蛋白或糖胺聚糖提取率(%)=1000Y/m

式中Y為吸光度，m為稱取樣品質(zhì)量(mg)。

2.2.4 綜合評分

糖胺聚糖與蛋白質(zhì)為美洲大蠊水提液中有效成分，設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)均為1。提取工藝優(yōu)化過程中，先算出糖胺聚糖及總蛋白質(zhì)的提取率，再根據(jù)下列公式計(jì)算綜合評分。

式中X＇為標(biāo)注化處理后的值即綜合評分，X為指標(biāo)的測量值，為不同試驗(yàn)號中該指標(biāo)測量值的平均值，S為不同試驗(yàn)號中該指標(biāo)測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.3 提取工藝的篩選

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,參考前期研究將pH值設(shè)定為8，選定料液比、超聲時(shí)間與提取溫度三個(gè)因素為自變量，蛋白質(zhì)及糖胺聚糖的提取率為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，對糖胺聚糖及蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)行篩選。

2.3.1 料液比的影響

在確保提取pH值為8、溫度為50 ℃、提取時(shí)間80 min的條件下，改變提取料液比為1∶30 1∶70 g·mL-1進(jìn)行超聲水提，考察料液比對總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響。

2.3.2 溫度的影響

在確保料液比1∶40 g·mL-1，提取時(shí)間為80 min、pH值=8不變下，改變超聲儀器溫度，在溫度為30～70 ℃下超聲水提，考察提取溫度對總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響。

2.3.3 超聲時(shí)間的影響

在確保液料比1∶40 g·mL-1，提取溫度50 ℃、pH值=8不變下，改變提取時(shí)間，在提取時(shí)間為60～100 min下超聲水提，考察提取時(shí)間對糖胺聚糖及總蛋白提取率的影響。

表1 因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對提取料液比、超聲時(shí)間與提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，總蛋白的提取率為25.94%～28.34%，糖胺聚糖的提取率為1.76%～2.42%。結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行方差分析，篩選最佳提取工藝條件為A1B1C1，其中總蛋白質(zhì)的提取率為27.79%、糖胺聚糖的提取率為2.31%，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2(續(xù))

表3 方差分析

注：P<0.05表示有顯著性差異。

3.2 單因素試驗(yàn)考察

3.2.1 料液比對提取率的影響

由圖1可知，總蛋白和糖胺聚糖的提取率隨料液比的增加同樣呈現(xiàn)先上升后略下降的趨勢，在料液比1∶50 g·mL-1時(shí)達(dá)到最高值。糖胺聚糖得率隨料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在料液比為1∶20～1∶40 g·mL-1范圍內(nèi)糖胺聚糖得率呈現(xiàn)逐步升高趨勢，由此可見當(dāng)溶劑用量不足時(shí)不能將有效成分充分溶出，而當(dāng)料液比提升至1∶40～1∶60 g·mL-1范圍時(shí)糖胺聚糖得率略有下降，可能由于溶劑量過高導(dǎo)致超聲效果充分發(fā)揮，從而降低糖胺聚糖得率。綜合雙指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果，料液比選擇1∶30～1∶50 g·mL-1范圍較為合適。

圖1 料液比對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

3.2.2 超聲時(shí)間對提取率的影響

圖2 超聲時(shí)間對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

由圖2可知，總蛋白質(zhì)提取率隨提取時(shí)間的增長，在60～100 min基本保持平穩(wěn)，時(shí)間對蛋白提取率的影響不明顯。糖胺聚糖的提取率隨時(shí)間增長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在60～80 min范圍內(nèi)，糖胺聚糖提取率不斷提升，推斷為隨時(shí)間延長，超聲促進(jìn)細(xì)胞破裂，有利于細(xì)胞內(nèi)糖胺聚糖的溶出；而糖胺聚糖提取率于80～100 min 時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢，可能由于產(chǎn)生時(shí)間過長導(dǎo)致糖胺聚糖結(jié)構(gòu)被破壞，糖鏈斷裂，使糖胺聚糖提取率下降。綜合雙指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲時(shí)間70～90 min較為合適。

3.2.3 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知，總蛋白質(zhì)的提取率隨著溫度的升高，在30～70 ℃區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)緩慢增長，隨溫度升高蛋白質(zhì)逐漸增加，溫度超過60 ℃時(shí)部分蛋白開始變性，蛋白質(zhì)的含量反而減小。糖胺聚糖提取率隨溫度的不斷提升，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在50 ℃時(shí)糖胺聚糖提取率達(dá)到最高值，溫度超過50 ℃范圍內(nèi)呈下降趨勢，推斷溫度過高會破壞糖胺聚糖間糖苷鍵，使糖胺聚糖含量降低。綜合雙指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度40～60 ℃較為合適。

圖3 溫度對美洲大蠊總蛋白及糖胺聚糖提取率的影響

上述結(jié)果分析表明,美洲大蠊水提液中總蛋白提取率，與溫度和料液比的關(guān)系較明顯，而糖胺聚糖的提取率與溫度和提取時(shí)間的關(guān)系較明顯。判斷各因素對美洲大蠊水提有效成分的影響因素大小為超聲時(shí)間>溫度>料液比，得到最優(yōu)工藝條件為A1B1C1。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出美洲大蠊蛋白質(zhì)和糖胺聚糖雙指標(biāo)的最佳提取工藝：精密稱取美洲大蠊1.0000 g，按1∶30料液比加入蒸餾水，超聲提取20 min，超聲溫度為50 ℃，加入胰蛋白酶2000 U(酶活力50000 U/g)，調(diào)節(jié)pH值為8，在37 ℃下酶解3 h后，在40 ℃超聲提取70 min得提取液，紫外光譜法測得糖胺聚糖提取率為2.31%、總蛋白質(zhì)提取率為27.79%以上，綜上本實(shí)驗(yàn)制備工藝簡單，利用胰蛋白酶進(jìn)行水提酶解，制備糖胺聚糖及蛋白質(zhì)得率較高，對臨床炎癥、腫瘤等疾病治療提供優(yōu)選藥液制備工藝。