UBE2T在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及臨床意義

石小康 丁佑銘 汪 斌 余 斌 徐 雨

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一，以肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)最為常見，約占70%～90%，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位，致死率位列第2[1]。2015年新增病例約466 100人，死亡約422 100人，值得注意的是，僅中國就占每年新增病例和死亡人數(shù)的一半以上[2]。肝癌早期臨床癥狀不明顯，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并診斷，故大多數(shù)確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后多較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)[3]，在我國經(jīng)年齡標(biāo)準(zhǔn)化后的5年生存率僅為10.1%左右。因此，亟需深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找敏感可靠的分子標(biāo)志物，以期為肝癌的早期診斷、有效治療及預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)。UBE2T是泛素結(jié)合酶E2家族成員之一，最初發(fā)現(xiàn)于范可尼貧血(Fanconi anemia，F(xiàn)A)患者。近年來研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌[4]、胃癌[5]、前列腺癌[6]、膀胱癌[7]等。也有研究報(bào)道其可以通過泛素化p53抑制其表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[8]。有鑒于此，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有數(shù)據(jù)探究UBE2T在肝癌組織中表達(dá)及其與肝癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步探究其相應(yīng)的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 收集數(shù)據(jù)資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//cancergenome.nih.gov/)下載371例肝癌組織樣本和50例正常肝組織樣本的mRNA seqV2表達(dá)譜數(shù)據(jù)集及相對應(yīng)的臨床病理資料。篩除部分?jǐn)?shù)據(jù)不詳資料，余下正常肝組織樣本50例，肝癌組織樣本365例，其中有314例包含完整的無病生存時(shí)間隨訪。同時(shí)從cBioPortal網(wǎng)站(美國國家癌癥研究所，http：//www.cbioportal.org/)下載TCGA數(shù)據(jù)集肝癌患者UBE2T基因改變數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 生存分析 UBE2T mRNA seqV2表達(dá)譜數(shù)據(jù)集經(jīng)log2處理后，將肝癌樣本按UBE2T的表達(dá)量高低排序，以UBE2T的表達(dá)量中位數(shù)為分組的界值，分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，表達(dá)量低于中位數(shù)值定義為低表達(dá)組，反之則為高表達(dá)組。利用Kaplan-Meier法分別分析兩組患者的總生存期(Overall survival，OS)和無病生存期(Disease-free survival，DFS)，并作Log-Rank檢驗(yàn)。

1.2.2 富集分析 使用GSEA 3.0軟件進(jìn)行基因富集分析(Gene set enrichment analysis)，按上述方法根據(jù)UBE2T表達(dá)量將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。利用GSEA網(wǎng)站中分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(Molecular Signatures Database，MsigDB)中獲得的c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集為參照數(shù)據(jù)集，按缺損加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)(Default weighed enrichment statistic)的方法，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次，進(jìn)行分析GSEA，以P<0.05，F(xiàn)DR<0.25為條件判斷顯著富集基因集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 6軟件作圖，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，UBE2T mRNA表達(dá)與肝癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2T在cBioPortal數(shù)據(jù)庫中的改變

cBioPortal數(shù)據(jù)庫包含348例(共371例，部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失)HCC患者的UBE2T基因表達(dá)數(shù)據(jù)。該隊(duì)列中22%(75/348)的HCC病例表現(xiàn)出UBE2T改變，其中包括61例mRNA上調(diào)，20例擴(kuò)增，6例既包括mRNA上調(diào)也包括擴(kuò)增，0例錯(cuò)義突變(圖1)。

圖1 UBE2T基因在肝癌組織中的改變Figure 1 The genomic alteration of UBE2T in HCC

2.2 UBE2T在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)

對TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2T在肝癌組織(n=371)和正常肝組織(n=50)表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示UBE2T在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

2.3 肝癌組織UBE2T表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

對UBE2T mRNA表達(dá)水平與肝癌患者的臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析后顯示，UBE2T與年齡(P=0.192)、性別(P=0.195)、TNM分期(P=0.140)無關(guān)，但與種族(P=0.034)、Grade分級(P<0.01)、有無血管侵襲(P=0.029)有關(guān)(表1)。

表1 UBE2T表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of UBE2T and clinicopathological parameters of patients with liver cancer

圖2 肝癌組織和癌旁組織中UBE2TmRNA的表達(dá)Figure 2 The expression of UBE2T in liver cancer and adjacent non-tumor tissues

2.4 UBE2T表達(dá)與肝癌患者OS的關(guān)系

Kaplan-Meier分析結(jié)果提示UBE2T的表達(dá)與肝癌患者OS有關(guān)(P=0.006)，與UBE2T低表達(dá)組相比，UBE2T高表達(dá)組患者的OS明顯降低(圖3A)。進(jìn)一步利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行了單因素和多因素分析。單因素分析結(jié)果顯示，UBE2T表達(dá)水平(P<0.01)、TNM分期(P<0.01)、血管侵襲(P<0.01)與肝癌患者OS顯著相關(guān)；多因素分析進(jìn)一步提示TNM分期(HR=1.63，95%CI：1.247～2.147，P=0.01)、血管侵襲(HR=1.33，95%CI：1.057～1.682，P=0.015)、UBE2T表達(dá)水平(HR=1.830，95%CI：1.273～2.641，P<0.01)是影響肝癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

2.5 UBE2T表達(dá)與肝癌患者DFS的關(guān)系

利用Kaplan-Meier法分析了UBE2T表達(dá)水平與肝癌患者DFS的關(guān)系，結(jié)果提示UBE2T高表達(dá)組的HCC患者DFS(P=0.005)明顯差于低表達(dá)組(圖3B)。單因素分析結(jié)果顯示，UBE2T表達(dá)水平(P=0.013)、TNM分期(P<0.001)、血管侵襲(P<0.001)與肝癌患者DFS相關(guān)；多因分析進(jìn)一步提示TNM分期(HR=1.985，95%CI：1.399～2.816，P<0.001)、血管侵襲(HR=1.721，95%CI：1.211～2.445，P=0.002)、UBE2T表達(dá)水平(HR=1.410，95%CI：1.044～1.905，P=0.025)是影響肝癌患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表3)。

2.6 UBE2T高表達(dá)組的GSEA功能富集分析

將TCGA的表達(dá)矩陣按照UBE2T的表達(dá)量分為高表達(dá)、低表達(dá)兩組進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果提示UBE2T高表達(dá)樣本富集到細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、DNA損傷堿基切除修復(fù)、RNA降解、前體RNA剪切、泛素介導(dǎo)蛋白水解等相關(guān)基因集(圖4)。提示UBE2T表達(dá)上調(diào)可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控、干擾基因的損傷修復(fù)及蛋白泛素化來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

圖3 UBE2T表達(dá)與肝癌患者OS和DFS曲線Figure 3 The OS and DFS curves of UBE2T expression in patients with HCC

表2 HCC患者OS影響因素的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of factors affecting OS in HCC patients

表3 HCC患者DFS影響因素的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of factors affecting DFS in HCC patients

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已處于中晚期，因而錯(cuò)失最佳治療的時(shí)機(jī)，故絕大多數(shù)患者預(yù)后極差[9]。鑒于目前的診療現(xiàn)狀，亟需尋找新的分子靶標(biāo)用于肝癌的早期診斷、預(yù)后判斷和靶向治療藥物的開發(fā)，以期更為積極有效的改善肝癌患者的不良預(yù)后。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫371例肝癌組織和50例正常肝組織樣本信息，研究了UBE2T表達(dá)與肝癌患者的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果表明，UBE2T在肝癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌患者的種族、Grade分級、血管侵襲等顯著相關(guān)。后續(xù)分析表明UBE2T表達(dá)水平、TNM分期、血管侵襲可顯著影響肝癌患者的預(yù)后，且UBE2T高表達(dá)組的肝癌患者預(yù)后明顯較低表達(dá)組患者預(yù)后差。由此推測，UBE2T表達(dá)上調(diào)可作為肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望成為潛在的判斷腫瘤患者預(yù)后的標(biāo)志和腫瘤治療的靶標(biāo)。

UBE2T是泛素結(jié)合酶E2家族成員之一，其具有一個(gè)大小約16～18 kDa特征性的保守結(jié)構(gòu)域-泛素結(jié)合(UBC)結(jié)構(gòu)域，最先發(fā)現(xiàn)于FA的相關(guān)研究中。UBE2T可作為范可尼信號通路(FA pathway)重要成員參與DNA損傷修復(fù)。DNA損傷通過激活范可尼通路，誘導(dǎo)泛素激活酶E1將泛素分子傳遞給UBE2T，UBE2T將泛素分子傳遞給該通路中的核心復(fù)合體，后者再將泛素分子傳遞給范可尼貧血互補(bǔ)基因群(Fanconi anemia group D2 protein，F(xiàn)ANCD2)，導(dǎo)致FANCD2單泛素化，單泛素化的FANCD2向細(xì)胞核DNA損傷點(diǎn)聚集，促進(jìn)DNA損傷分子的修復(fù)，進(jìn)而維持基因組的完整性。作為該通路的重要組成部分，UBE2T的表達(dá)異常會導(dǎo)致基因組穩(wěn)定性下降，誘發(fā)范可尼貧血或腫瘤易感傾向。本文通過富集分析發(fā)現(xiàn)，UBE2T高表達(dá)主要富集在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、DNA損傷堿基切除修復(fù)、RNA降解、前體RNA剪切、泛素介導(dǎo)蛋白水解等相關(guān)基因集。提示UBE2T表達(dá)上調(diào)可以通過干擾基因的損傷修復(fù)及蛋白泛素化來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

諸多文獻(xiàn)報(bào)道UBE2T在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤中異常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)UBE2T參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)UBE2T可以通過AKT/GSK3β/β-catenin通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Ueki等[11]研究發(fā)現(xiàn)UBE2T可通過抑制抑癌基因BRCA1的表達(dá)而發(fā)揮其癌基因的作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道EMT與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。EMT使上皮細(xì)胞的細(xì)胞極性消失，失去與基底膜的連接，明顯增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。EMT在分子水平上主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮型鈣黏附蛋白(E-Cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)等的表達(dá)下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖粘蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)等的表達(dá)上調(diào)[14]。Luo等[15]報(bào)道UBE2T可以通過調(diào)控EMT相關(guān)因子如E-Cadherin、β-Catenin、Fibronectin、Vimentin的表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的UBE2T亦可作用于Vimentin介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT過程[16]。關(guān)于UBE2T是否可以同樣的機(jī)制促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展，曹傳輝等[17]通過免疫印跡方法檢測UBE2T過表達(dá)和RNAi干擾后肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化，證明UBE2T可通過EMT促進(jìn)肝癌細(xì)胞的的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。亦有研究[16]通過UBE2T基因過表達(dá)和敲除技術(shù)，證實(shí)了UBE2T高表達(dá)可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。不僅如此，Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)UBE2T還可通過泛素化P53抑制其表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。由此可鑒，UBE2T與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。綜上，UBE2T極有潛力作為臨床肝癌早期診斷、預(yù)后判斷及治療的新靶點(diǎn)。

本研究利用生物信息學(xué)原理分析了UBE2T在肝癌患者中的表達(dá)差異及其與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究UBE2T在肝癌中的基礎(chǔ)和臨床研究提供線索和依據(jù)。但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究其在肝癌中的具體作用機(jī)制，以期為肝癌的臨床診斷和治療提供新方向。