Chk1在膠質母細胞瘤中的表達及其與腫瘤生物學行為和預后生存的關聯性

白曉斌 霍龍偉 謝萬福 徐高峰 王茂德

膠質母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)是一種惡性原發(fā)性腦腫瘤，早期接受手術聯合規(guī)范放、化療的情況下仍會在短期內復發(fā)，復發(fā)腫瘤往往惡性程度更高且再次放化療效果甚微，中位生存期僅為12～15個月[1-2]。細胞周期檢查點(Checkpoint)是一類細胞周期中保證染色體分配質量和DNA正確復制的負反饋檢查機制[3]。細胞周期檢測點激酶1(Checkpoint kinase 1，Chk1)是一類協調DNA合成以及調節(jié)細胞周期正常進程的重要效應分子[4]，研究證實Chk1過量表達與肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、復發(fā)以及治療耐受高度相關[4-9]，但是其在GBM中的表達及其與生物學行為和預后生存相關性尚不明確。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；聚丙烯酰胺凝膠購自Life Technology公司；HRP標記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗、Tris-MOPS SDS電泳緩沖液和Western blot轉膜所用的Transfer Buffer購自Thermo Fisher公司；抗Chk1抗體購自LifeSpan公司；抗β-actin抗體購自Abcam公司；siCHEK1慢病毒購自ABM公司。

1.2 資料收集整理

蛋白激酶基因差異表達結果通過TCGA數據庫利用Bioconductor/TCGA biolink下載，利用Rembrandt數據庫(http：//www.betastasis.com/glioma/rembrandt/)分析驗證GBM和正常腦組織以及其它類型膠質瘤中蛋白激酶Chk1基因表達差異，并通過Rembrandt數據庫利用Kaplan-Meier生存分析研究高低表達Chk1與臨床預后的關系。

研究同時納入西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經外科40例經過手術病理切除GBM患者，男性24例，女性16例；年齡24～71歲，平均(58.62±8.25)歲；病變部位包括丘腦、島葉、頂葉、顳葉和額葉；GBM患者存在不同程度頭痛、惡心、肢體活動和言語障礙。GBM患者信息獲取以及發(fā)表經過患者本人或家屬同意。

1.3 細胞培養(yǎng)

GBM細胞系(U87，U251，SHG-44)購自上海富衡生物科技有限公司，GBM細胞使用含有10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基至多每7～10天更換一次，加入Accutase酶在37℃，5% CO2條件下消化5 min至細胞脫壁后轉移至離心管內，加入等體積培養(yǎng)基終止消化反應，800 rpm離心5 min，棄上清后加入5 mL PBS洗去殘余培養(yǎng)基，再行800 rpm離心5 min，注入5 mL新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基重懸，采用全自動細胞計數儀進行細胞計數后轉移至培養(yǎng)瓶內，于37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 體外細胞增殖實驗

GBM細胞系U87細胞傳代至第三代時進行細胞計數，并將細胞(1×104個/ mL )接種至96孔板內，每孔接種1 mL，加入20 μL細胞增殖檢測試劑(Alarma blue)，一次測量6個復孔，輕輕晃動搖勻之后在37℃，5% CO2條件下孵育8 h，利用熒光分光光度計測量在530 nm和590 nm波長處的吸光度值。體外細胞增殖實驗應分別在接種后0 d、2 d、4 d、6 d和8 d分別進行，根據檢測所得結果繪制細胞體外增殖曲線。

1.5 Western blot檢測

分別收集GBM細胞系(U87，U251，SHG-44)和正常人星型膠質細胞系(NHA)，在4℃條件下，經過RIPA蛋白裂解液裂解30 min后，收集總蛋白，經過考馬斯亮藍法對總蛋白進行定量后。利用分離膠(8%)以及濃縮膠(5%)對30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。轉模和蛋白封閉后，在4℃下孵育抗β-actin抗體過夜，洗膜處理后進行二抗孵育，接著進行顯影和成像，利用Image J軟件后進行蛋白分析。

1.6 體外細胞成球試驗

GBM細胞系U87細胞傳代至第三代時進行細胞計數，并將單細胞懸液稀釋至1×102個/mL細胞濃度，依次按照0、1、10、20、40、50細胞/孔接種至96孔板內，每個濃度設置10個復孔輕晃混勻后在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。統計各濃度復孔中無細胞球形成的孔數并計算其比率，利用Prism 6.0進行線性回歸分析。

1.7 實時定量熒光PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR的詳細步驟參考已發(fā)表的相關論文[10]。GAPDH作為內參基因，實驗所用的引物序列如下：Chk1-Forward：ATATGAAGCGTGCCGTAGACT，Chk1-Reverse：TGCCTATGTCTGGCTCTATTCTG，GAPDH-Forward：GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA，GAPDH-Reverse：TTGAGGTCAATGAAGGGGTC。

1.8 免疫組化染色

根據試劑盒說明書采用辣根過氧化物酶法檢測Chk1，詳細步驟參考已發(fā)表的相關論文[10]。染色結果由2名以上的研究員分別進行觀察統計，染色結果按照德國免疫組化評分標準(German immunohistochemical score，GIS)進行評估。具體評分標準為：陽性細胞比率評分：0分(無陽性細胞)，1分(陽性細胞比率<10%)，2分(11%<陽性細胞比率<50%)，3分(51%<陽性細胞比率<80%)，4分(陽性細胞比率>80%)；染色強度評分：0分(無染色)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(強染色)；GIS評分結果為陽性細胞比率評分×染色強度評分。目的蛋白表達量的評判標準為：GIS評分<5分：低表達；5分≤GIS評分≤8分：中度表達；GIS評分>8分：高表達。

1.9 慢病毒轉染

GBM細胞系U87細胞傳代至第三代時進行細胞計數，并4×105個/mL接種1 mL至預先用層粘連蛋白處理過的無菌六孔板中，37℃，5% CO2條件下孵育6 h待細胞完全貼壁；將購得的siChk1慢病毒在冰上溶化后，在3 mL培養(yǎng)基中加入3 μL聚凝胺和20 μL慢病毒，混合充分后加入6孔板中；轉染12 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達評估轉染效率，如轉染效率滿意，移除含有慢病毒的培養(yǎng)基后注入3 mL Accutase消化液消化細胞后，加入3 mL培養(yǎng)基終止反應，室溫下800 r/min離心5 min；移除上清液后加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，輕柔吹打后將細胞懸液接種至無菌培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。轉染通過Real-time PCR及Western blot進行驗證。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 Chk1在GBM組織和細胞中的表達

通過對TCGA數據庫中668個蛋白激酶編碼基因的表達進行分析[11]，結果發(fā)現同正常腦組織相比，Chk1是在GBM中表達上調最為顯著的蛋白激酶編碼基因之一(圖1)。同時，對Rembrandt數據庫的分析結果顯示Chk1在GBM中的表達顯著高于正常腦組織及其他類型膠質瘤(圖2)。為了進一步研究Chk1在GBM細胞中的表達情況，本研究利用Realtime PCR和Western blot對3株GBM細胞系(U87，U251，SHG-44)和1株正常人星形膠質細胞(NHA)中Chk1的表達進行測定，結果顯示GBM細胞中Chk1的mRNA和蛋白水平均顯著上調(圖3，圖4)。

圖2 Chk1在GBM組織中的表達高于正常腦組織及其他類型膠質瘤組織Figure 2 Chk1 gene was highly expressed in GBM in comparison with normal brain tissues and other subtypes of glioma cells.Note：** P<0.01，*** P<0.001，ns P>0.05.

圖1 Chk1在GBM組織中高表達Figure 1 Chk1 gen was highly expressed in GBM tissues

圖3 Real-time PCR結果顯示Chk1在GBM細胞(U87，U251，SHG-44)中高表達Figure 3 Chk1 at mRNA level was highly expressed in GBM U87，U251 and SHG-44 cellsNote：** P<0.01，*** P<0.001.

圖4 Western blot結果顯示Chk1在GBM細胞(U87，U251，SHG-44)中高表達Figure 4 Chk1 protein was highly expressed in GBM U87，U251 and SHG-44 cells

圖5 Real-time PCR結果顯示siChk1轉染U87細胞中Chk1表達下調Figure 5 Real-time PCR analysis indicated Chk1 was decreased after siChk1 transfection in U87 cellsNote：**P<0.01.

圖6 Western blot結果顯示siChk1轉染U87細胞中Chk1表達下調Figure 6 Western blot analysis indicated Chk1 was decreased after siChk1 transfection in U87 cells

2.2 Chk1能夠促進GBM細胞的體外增殖和成球能力

為了進一步說明Chk1對GBM細胞生物學行為的影響，本研究通過慢病毒轉染技術特異性沉默GBM細胞中Chk1表達，Real-time PCR和Western blot結果顯示：沉默后GBM細胞與對照細胞相比，Chk1表達顯著下降(圖5，圖6)。同對照組相比，沉默Chk1表達后GBM細胞的增殖能力(P<0.01)和體外成球能力(P<0.05)顯著受到抑制，表明Chk1對GBM細胞的增殖和成球能力具有促進作用(圖7，圖8)。

圖7 體外增殖實驗顯示siChk1 U87細胞的增殖能力顯著受到抑制Figure 7 Chk1 knock-down reduced cell proliferation of U87 cellsNote：**P<0.01，compared with the control.

圖8 體外成球實驗顯示siChk1 U87細胞的成球能力顯著受到抑制Figure 8 Chk1 knock-down reduced colony-formation in U87 cellsNote：*P<0.05，compared with the control.

2.3 Chk1高表達與GBM患者不良預后相關

收集自2010—2016年期間就診于我院的GBM患者病理組織切片共40例，利用免疫組化染色對Chk1的表達進行分析(圖9)，并對Chk1的表達和患者預后生存相關性進行研究，結果表明Chk1低表達組GBM患者的臨床預后顯著優(yōu)于高表達組患者(圖10)。與此相似，對Rembrandt數據庫中537例GBM患者的預后和Chk1表達進行分析，結果顯示Chk1高表達同GBM患者的不良預后高度相關(圖11)，提示Chk1可能作為預測GBM患者預后的分子標志物，具有一定的臨床應用前景。

圖9 利用免疫組化染色分析GBM腫瘤中Chk1的表達Figure 9 The expression of Chk1 protein in GBM tissues by immunohistochemistry

圖10 Chk1高表達同GBM患者的不良預后高度相關Figure 10 The expression of Chk1 was correlated to poor prognosis in GBM patients

圖11 Rembrandt數據庫分析結果顯示Chk1高表達同GBM患者的不良預后高度相關Figure 11 The expression of Chk1 was correlated to poor prognosis in GBM patients from Rembrandt database

3 討論

GBM是一類復發(fā)率高和預后較差的嚴重神經系統腫瘤，其5年生存率低于5%[12-13]。蛋白激酶因其參與細胞生物學行為調控以及基因修復等重要生命活動而得到廣泛關注[14]。Chk1是一種含有200個氨基酸的復合物，通過磷酸化活化激活ATM/R激酶[15]。Chk1同多種腫瘤的發(fā)生和復發(fā)有關，其重要生物學功能之一是通過誘導DNA修復進而使細胞獲得對放療及某些化療藥物的耐受性[8]。Matsumoto等[16]通過臨床研究檢測發(fā)現嘧啶類似物吉西他濱能夠激活原發(fā)性肝癌和膽管癌中Chk1活性并且能激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)1/2，增加腫瘤細胞的DNA修復并減少其凋亡，進而增強其對吉西他濱的耐受性。另有研究通過免疫組化測定Chk1在子宮頸癌和慢性子宮頸炎患者中的陽性率，發(fā)現子宮頸癌的陽性表達顯著上升[5，9]。除此之外，在生殖系統腫瘤包括女性卵巢癌和男性前列腺癌中，Chk1信號分子被激活，表達顯著增高，參與腫瘤細胞生物學行為的改變[17]。雖然Chk1被證實同多種腫瘤的發(fā)生相關并通過多種分子生物學機制參與調控腫瘤細胞的生物學行為，但是Chk1在膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤中的作用仍不明確。本研究通過TCGA數據庫和腦腫瘤分子數據庫(Rembrandt)選擇和分析GBM中Chk1的表達并采用Western blot和Real-time PCR等分子生物學技術檢測GBM細胞中Chk1的表達水平，同時利用慢病毒轉染siRNA沉默Chk1的表達以探究其對于GBM細胞增殖能力的作用；同時利用免疫組化染色及Rembrandt數據庫對Chk1同GBM患者的預后生存進行分析，結果表明Chk1在GBM中高表達，而特異性沉默Chk1能夠顯著抑制GBM細胞的生長和成球能力；同時，Chk1低表達組GBM患者的臨床預后顯著優(yōu)于高表達組患者，證實了Chk1表達上調能夠促進GBM細胞的生長和增殖，并和GBM患者的不良預后相關，提示Chk1可能作為GBM臨床治療和藥物研發(fā)新的潛在靶點，為GBM治療提供了新想法。

Chk1促進腫瘤生長的機制主要是調控ATR-Chk1信號轉導通路，從而啟動細胞損傷修復程序，能夠顯著提高腫瘤細胞化學治療的耐受性[18]。Lam等[19]通過文獻復習指明Chk1在調控細胞生長和維持細胞周期和基因信息穩(wěn)定性方面具有重要意義。Kohn等[20]通過反復驗證發(fā)現，Chk1在p53突變的人乳腺癌MDA-MB-231細胞周期調控中起關鍵作用，Chk1抑制劑UCN-01能夠恢復細胞周期異常。盡管我們的研究發(fā)現Chk1對于GBM細胞的生長具有重要的調控作用，但其分子生物學機制尤其是下游信號轉導通路仍需進一步深入的研究。值得注意的是，Levesque等[21]證實Chk1不僅在腫瘤細胞的生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用，而且抑制Chk1能夠影響正常細胞的生物學行為，因此抗Chk1靶點藥物抗腫瘤效果還存在一定爭議。因此，Chk1表達與GBM生物學行為和臨床預后相關性尚需要進一步的探索和研究。