應(yīng)用以人轉(zhuǎn)錄組為靶點(diǎn)的shRNA文庫(kù)篩選肺癌腫瘤相關(guān)抑制基因

徐 暉 李 希 周春水

肺癌的腫瘤形成是一種復(fù)雜的多因素、多步驟過(guò)程，它涉及多種遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)上的異常變化[1-3]，這些惡性表型歸根結(jié)底都是控制這些生理過(guò)程的基因發(fā)生了異常改變。因此，發(fā)現(xiàn)并且闡明在腫瘤起源和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用的腫瘤抑制基因成為腫瘤防治中的中心任務(wù)，新型腫瘤相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)也為開發(fā)新型腫瘤治療方法提供更有效、更有針對(duì)性的藥物靶標(biāo)[4]。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的針對(duì)人轉(zhuǎn)錄組的shRNA文庫(kù)為全基因組功能缺失性篩選提供了有力工具。shRNA文庫(kù)由大量針對(duì)驗(yàn)證的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的shRNA克隆組成[5-7]。通過(guò)shRNA文庫(kù)及腫瘤細(xì)胞的錨定不依賴性生長(zhǎng)特性已經(jīng)在乳腺癌中篩選了包括PTPN12在內(nèi)的多種腫瘤抑制基因[8]。本研究擬通過(guò)應(yīng)用shRNA文庫(kù)篩選肺癌相關(guān)的腫瘤抑制基因，為今后大規(guī)模、高效率的篩選更多種類的抑癌基因奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 shRNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝

以300萬(wàn)細(xì)胞/孔將GP2-293細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。24 h后進(jìn)行shRNA文庫(kù)(pSM2c_shRNAmir 1.1-1.6，Hannon-Elledge 文庫(kù))轉(zhuǎn)染，選取3.1～3.6亞庫(kù)進(jìn)行病毒包裝，包裝體系如下：VSVG for retro 12 μg、shRNA文庫(kù)12 μg、Opti-MEM 1.5 mL、Mirus 60 μL，室溫作用20 min，分別加入到GP2-293細(xì)胞中。以此時(shí)間為零點(diǎn)，零點(diǎn)之后的第48 h吸取上清(病毒在上清中)，然后再加入新鮮的培養(yǎng)基，零點(diǎn)之后的72 h吸取上清。將病毒液以800 rpm離心5 min后用0.45 μM濾膜過(guò)濾，-80℃凍存。

1.2 shRNA文庫(kù)包裝病毒感染BEAS-2B細(xì)胞

培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，將BEAS-2B細(xì)胞種六孔板，30萬(wàn)細(xì)胞/孔。以MOI為1加入文庫(kù)包裝的病毒。加入終濃度為0.5 μg/mL的puromycin篩選病毒陽(yáng)性感染細(xì)胞。

1.3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選錨定不依賴性生長(zhǎng)BEAS-2B細(xì)胞系

配制底層瓊脂：微波爐中溶解1.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖，水浴鍋中冷卻到40℃。將2×培養(yǎng)基放入40℃水浴鍋中。加等體積的1.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×培養(yǎng)基，使瓊脂糖終濃度為0.8%。將其倒入10 cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿10 mL。室溫冷卻至凝固。配制上層瓊脂：微波爐中溶解3.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖，并將其放入40℃水浴鍋中。消化puromycin篩選的文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，800 rpm離心5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞濃度配制成10萬(wàn)細(xì)胞/mL。在50 mL離心管中加入3.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖3 mL，BEGM培養(yǎng)基27 mL，細(xì)胞450 μL。每10 cm培養(yǎng)皿加入10 mL混合液，此時(shí)細(xì)胞數(shù)為1.5萬(wàn)細(xì)胞/10 cm培養(yǎng)皿。室溫冷卻至凝固。將培養(yǎng)皿放入37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)3周，每三天加入1.5 mL BEGM培養(yǎng)基。

1.4 新腫瘤抑制基因的篩選

從軟瓊脂平板中挑取單個(gè)克隆放入24孔板中培養(yǎng)。逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)至6 cm培養(yǎng)皿中。提取細(xì)胞全基因組DNA(按照Qiagen試劑盒方法提取)。PCR擴(kuò)增基因組DNA片段，根據(jù)MSCV-PM-mir30質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)通用引物，由北京英駿公司合成引物序列，如表1所示。PCR產(chǎn)物測(cè)序并應(yīng)用Pubmed blast分析其對(duì)應(yīng)的人類基因名稱。

表1 MSCV-PM-mir30擴(kuò)增通用引物Table 1 Primers for MSCV-PM-mir30 amplification

1.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因沉默后BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況

對(duì)候選基因INPP4B所在的細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配制底層瓊脂及上層瓊脂，方法同前所述。消化puromycin篩選的文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，800 rpm離心5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞濃度配制成10萬(wàn)細(xì)胞/mL。在50 mL離心管中加入3.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖3 mL，BEGM培養(yǎng)基27 mL，細(xì)胞450 μL。每10 cm培養(yǎng)皿加入10 mL混合液，此時(shí)細(xì)胞數(shù)為1.5萬(wàn)細(xì)胞/10 cm培養(yǎng)皿。室溫冷卻至凝固。將培養(yǎng)皿放入37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)3周，每三天加入1.5 mL BEGM培養(yǎng)基。每個(gè)10 cm培養(yǎng)皿加入1 mL結(jié)晶紫溶液，室溫1 h，照相，計(jì)數(shù)10 cm培養(yǎng)皿中克隆形成數(shù)量。

1.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEAS-2B shFF2、BEAS-2B shINPP4B沉默細(xì)胞，將其接種于96孔板中，2000細(xì)胞/孔，每種細(xì)胞接種六個(gè)復(fù)孔。接種七塊相同的96孔板。24 h后取其中的一塊96孔板，吸去培養(yǎng)基，PBS洗三次。每孔加入培養(yǎng)基200 μL，CellTiter96?Aqueous One Solution Reagent 20 μL，37℃孵箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光吸收值。每天重復(fù)測(cè)定一次，共測(cè)定7次。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因沉默后BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況

對(duì)含有shINPP4B沉默基因的BEAS-2B細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)，每種細(xì)胞取5×107個(gè)細(xì)胞接種裸鼠皮下，接種3周后測(cè)量腫瘤體積的大小。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法對(duì)克隆形成及裸鼠成瘤大小及體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MTT實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

與shFF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)目較多，并可形成較大的克隆。對(duì)MSCV-PM-shFF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞及文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的軟瓊脂平板所形成的的細(xì)胞團(tuán)(直徑>1 mm)進(jìn)行計(jì)數(shù)，shFF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆形成數(shù)為86±20，文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆形成數(shù)205±35，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)(圖1)。

圖1 shFF2及文庫(kù)轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)Figure 1 The number of colony formation between BEAS-2B cells infected with shFF2 and cells transfected with shRNA libraryNote：A.Cells transfected with shFF2；B.Cells transfected with shRNA library；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and cells transfected with shINPP4B.

2.2 新腫瘤抑制基因的篩選

所插入的shRNA基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序后，用blast 發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的靶基因并剔除重復(fù)測(cè)序基因(表2)。

表2 BEAS-2B細(xì)胞候選腫瘤抑制基因Table 2 Candidates of malignant transformation suppressors were identified in BEAS-2B cells by the shRNA library targeting transcriptome

2.3 候選基因INPP4B沉默效果檢測(cè)

選取INPP4B作為候選腫瘤抑制基因。將軟瓊脂平板上的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，Western blot驗(yàn)證基因沉默效果?？梢妔hINPP4B沉默組相應(yīng)基因表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)(圖2)。

2.4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因沉默后BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況

將含有shINPP4B的BEAS-2B細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種軟瓊脂平板，待細(xì)胞生長(zhǎng)三周后結(jié)晶紫染色，照相。shINPP4B組細(xì)胞克隆數(shù)較多，體積較大。說(shuō)明當(dāng)INPP4B沉默后，細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。顯微鏡下觀察，shFF2對(duì)照組細(xì)胞零星分布于平板中，shINPP4B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較密集，數(shù)量較多。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，shFF2對(duì)照組、shINPP4B組分別為(205±40)個(gè)/10 cm培養(yǎng)皿、(618±36)個(gè)/10 cm培養(yǎng)皿(圖3)，實(shí)驗(yàn)組組與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003)(圖3)。

圖2 INPP4B沉默細(xì)胞中INPP4B蛋白水平檢測(cè)Figure 2 The level of INPP4B protein in BEAS-2B cells silenced with shINPP4BNote：A.The expression of INPP4B in BEAS-2B cells transfected with shINPP4B and shFF2；B.The intensity of protein INPP4B bands was quantified with a densitometry.

圖3 BEAS-2B細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)Figure 3 The colony formation in BEAS-2B cellsNote：A.BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and shINPP4B.

2.5 MTT法檢測(cè)INPP4B基因沉默后BEAS-2B細(xì)胞增殖情況

取shFF2對(duì)照組，shINPP4B沉默BEAS-2B細(xì)胞系，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖速度，在490 nm處讀取吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，shINPP4B沉默組細(xì)胞增殖速度均高于shFF2對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖4)。

2.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因沉默后BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況

FF2對(duì)照組、shINPP4B轉(zhuǎn)染組腫瘤重量分別為(0.156±0.071)g，(0.844g±0.074)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。FF2對(duì)照組、shINPP4B轉(zhuǎn)染組腫瘤體積分別為(69.02±31.48)mm3，(874.56±60.80)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖5)。

圖4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖Figure 4 Proliferative curves of BEAS-2B cells transfected with shFF2 or shINPP4B

圖5 BEAS-2B細(xì)胞裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)Figure 5 Xenografts in nude miceNote：A.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The tumor weight between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B；D.The volume of tumor between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B.

3 討論

shRNA文庫(kù)一般采用的是鼠源逆轉(zhuǎn)錄病毒(MSCV)或慢病毒(Lentivirus)作表達(dá)載體。shRNA文庫(kù)保存形式有列陣(Arrayed)文庫(kù)和集合(Pooled)文庫(kù)。Arrayed文庫(kù)能用于高通量圖像分析以及探測(cè)細(xì)胞周期變化。Pooled文庫(kù)需要的試劑少，成本小，便于進(jìn)行大規(guī)模、高效率功能篩選。shRNA-mir文庫(kù)靶點(diǎn)涵蓋廣、基因沉默效率高，可廣泛應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行腫瘤抑制基因的篩選。為了研究肺癌發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的腫瘤抑制基因，我們應(yīng)用shRNA文庫(kù)進(jìn)行腫瘤抑制基因的篩選。

哈佛大學(xué)Elledge實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用shRNA-mir文庫(kù)和體外軟瓊脂細(xì)胞克隆形成這兩種技術(shù)在永生化的乳腺上皮細(xì)胞中篩選出PTPN12等多個(gè)新型腫瘤抑制基因。由于不同來(lái)源的細(xì)胞基因略微有些差別，而美國(guó)乳腺癌占有很大的比例，所以哈佛大學(xué)的研究主要集中在對(duì)乳腺上皮的永生化細(xì)胞腫瘤抑制基因的篩選上。而在過(guò)去的30年，中國(guó)肺癌死亡率逐年增加，肺癌已經(jīng)超過(guò)肝癌，成為癌癥死亡的首要病因[9]。上海、遼寧更是肺癌高發(fā)城市。根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)，2025年，中國(guó)新增肺癌人數(shù)將達(dá)每年100萬(wàn)。因此我們主要針對(duì)肺腫瘤抑制基因進(jìn)行研究。我們利用研究中較常見的永生化肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，應(yīng)用shRNA文庫(kù)技術(shù)篩選肺上皮腫瘤抑制基因，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)在肺癌過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的肺腫瘤抑制基因，這在之前的研究中未見報(bào)道。

在本研究中，我們應(yīng)用shRNA文庫(kù)篩選技術(shù)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)在肺支氣管上皮細(xì)胞全基因組中分離出100個(gè)分離較好，較大的克隆，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、基因組比對(duì)確定了6個(gè)肺腫瘤抑制基因候選基因，分別為INPP4B、Sesn2、TIAR、ACRC、NUP210、LMTK3。其中INPP4B已證實(shí)可能是乳腺癌及前列腺癌的腫瘤抑制基因[10-11]，但在肺癌發(fā)生中的作用未見報(bào)道。Sesn2是p53基因的靶蛋白，對(duì)mTOR通路具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[12]。TIAR是RNA結(jié)合蛋白，對(duì)細(xì)胞凋亡、病毒復(fù)制、感染、代謝應(yīng)激具有調(diào)節(jié)作用，下調(diào)TIAR蛋白的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，有文獻(xiàn)報(bào)道稱其可能是腫瘤抑制基因[13]。ACRC的功能未知，有報(bào)道稱與帕金森病有關(guān)。NUP210是210KD的核孔蛋白，其表達(dá)可能決定細(xì)胞的命運(yùn)[14]。LMTK3蛋白的表達(dá)水平可影響乳腺癌對(duì)藥物的敏感性，對(duì)于腫瘤內(nèi)蛋白質(zhì)LMTK3水平較高的患者，一些常規(guī)藥物的療效不佳，患者存活時(shí)間較短，而蛋白表達(dá)水平較低的患者，對(duì)藥物的敏感性更好存活時(shí)間較長(zhǎng)。其可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)[15]。

由于本研究通過(guò)shRNA文庫(kù)篩選了幾個(gè)已知的腫瘤抑制基因及幾個(gè)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)的候選基因限制肺癌細(xì)胞的錨定不依賴性生長(zhǎng)，說(shuō)明通過(guò)shRNA篩選腫瘤抑制基因的方法有效。根據(jù)已有文獻(xiàn)的報(bào)道，我們選取了INPP4B作為肺腫瘤抑制基因的優(yōu)先候選基因。

當(dāng)肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B沉默了INPP4B基因后，細(xì)胞在軟瓊脂平板上形成的克隆數(shù)較對(duì)照組克隆增大，數(shù)目增多。沉默了INPP4B基因后細(xì)胞增殖速度增快在裸鼠皮下注射后可形成較大的腫瘤，說(shuō)明肺支氣管上皮細(xì)胞可能發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化，但其具體通過(guò)的機(jī)制不明，我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。我們通過(guò)shRNA文庫(kù)及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)合測(cè)序分析，初步探討了發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因的一種方法，為今后大規(guī)模的篩選工作奠定了基礎(chǔ)。