蘋果組培外植體消毒及培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)研究

龐 曼 李 娜 張 心 高玉倩 張蒙蒙 張彥坤

（1河北慕旭農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北 定州 073006；2河北省林業(yè)科學(xué)研究院 河北 石家莊 050061；3定州市科學(xué)技術(shù)局 河北 定州 073006）

蘋果屬于薔薇科，蘋果屬，是世界主要栽植果樹品種之一。落葉喬木，葉橢圓形，有鋸齒；果實(shí)球形，味甜，營養(yǎng)豐富；果肉清脆香甜，能幫助消化。我國蘋果的總產(chǎn)量和栽培面積均位居世界第一，但是蘋果品質(zhì)差、單產(chǎn)低、總體生產(chǎn)水平比較落后，導(dǎo)致這種現(xiàn)狀的主要因素之一是蘋果病毒病的侵害。

目前應(yīng)用在蘋果育苗上的脫毒方法有很多，但是應(yīng)用比較廣泛的主要是莖尖培養(yǎng)、熱處理以及抗病毒劑方法。國內(nèi)在種苗組培快繁、脫毒方面做了很多的研究工作，但只有少量品種進(jìn)入工廠化生產(chǎn)階段，盡管組培苗的生產(chǎn)具有繁殖周期短、繁殖系數(shù)高、不受生長季節(jié)限制、生產(chǎn)種苗質(zhì)量好、整齊度高、可脫去部分植物病毒等諸多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一次性投資大、成本高、技術(shù)步驟繁雜、技術(shù)易傳性差、試管苗成活率低、推廣難度大等缺點(diǎn)。因而如何降低生產(chǎn)成本，簡化工藝，提高繁殖系數(shù)和成活率，達(dá)到規(guī)模化、商品化生產(chǎn)是組培技術(shù)研究的重要方向[1]。本試驗(yàn)就組培過程中外植體消毒和培養(yǎng)基的優(yōu)化以及接種方面進(jìn)行了研究，為蘋果育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。幼苗：取自公司大棚內(nèi)蘋果小苗。其他材料：MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-BA、吲哚丁酸(IBA)、升汞(0.1%)、酒精(95%)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理。2016年4月中旬，從待脫毒蘋果苗上剪取接穗，采用切接法嫁接在盆栽實(shí)生砧苗上，嫁接成活后，按常規(guī)苗在室外進(jìn)行管理。經(jīng)過一年培育后，于第二年在定州市東亭鎮(zhèn)國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)的智能溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于地面以上15 cm剪截留5個左右飽滿芽，待蘋果苗萌動長出幼葉后，進(jìn)行熱處理脫毒，具體方法：將其移入恒溫?zé)崽幚硐?，?0℃下處理2d后，每天升高1℃，當(dāng)溫度升至36℃時(shí)，處理2 d，升至37℃時(shí)處理2 d，然后在38℃下恒溫處理30 d[2]。

1.2.2 外植體的獲取。在熱處理過程中長出的新梢頂端切取2～3cm的頂尖作為外植體，在低倍顯微鏡下剝離幼葉和葉原基，切取0.3～0.5mm的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2.3 外植體消毒處理。使用75%酒精和0.1%升汞進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為酒精10 s、15 s、20 s，升汞8 min、10 min?；A(chǔ)培養(yǎng)基分別為MS+蔗糖30 g/L、2/3MS+蔗糖20 g/L、1/2MS+蔗糖15 g/L、1/3MS+蔗糖10 g/L，其他配比：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6 g/L瓊脂。

1.3 指標(biāo)計(jì)算方法

污染率(%)=(真菌或者細(xì)菌污染的芽數(shù)/供試芽數(shù))×100%

成活率(%)=(未死亡的芽數(shù)/未被污染的芽數(shù))×100%

萌發(fā)率(%)=(轉(zhuǎn)綠的芽數(shù)/接種數(shù))×100%

褐化率(%)=(產(chǎn)生褐化芽數(shù)/接種數(shù))×100%

注：此處的接種數(shù)為不含污染的芽數(shù)

生長狀況描述：莖尖萎蔫、莖尖微黃、莖尖淡綠、莖尖濃綠。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精和升汞不同消毒時(shí)間對蘋果外植體的影響。從表1可以看出，升汞消毒10min時(shí)，成活率都不高，污染率為最低48%，但成活率只有30%，說明升汞對外植體的傷害比較大；酒精消毒15s時(shí)最為適宜，消毒時(shí)間過低表面殺菌不徹底，太高對外植體有傷害作用。綜合考慮，酒精消毒15s，升汞消毒8min最適宜。

表1 酒精和升汞不同消毒時(shí)間組合對蘋果外植體的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對蘋果外植體誘導(dǎo)影響。從表2中可以看出，2/3MS培養(yǎng)基最有利于蘋果外植體的誘導(dǎo)，而且其生長狀態(tài)也是最好，但總體來說褐化現(xiàn)象還是比較嚴(yán)重。

表2 不同培養(yǎng)基對蘋果外植體誘導(dǎo)影響

2.3 接種次數(shù)對外植體褐化的影響。從表3可以看出，隨著接種次數(shù)的增加，外植體褐化率明顯下降，考慮成本因素，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基的次數(shù)為4時(shí)，可達(dá)到理想的效果。

表3 接種次數(shù)對外植體褐化的影響

3 結(jié)論和討論

在植物離體培養(yǎng)中，外植體消毒是組培的關(guān)鍵技術(shù)，常用的外植體消毒試劑比較多，主要有次氯酸鈉、過氧化氫、酒精、升汞等，次氯酸鈉的滅菌作用很強(qiáng)，易去除，但其堿性很強(qiáng)，對幼嫩植體的毒害作用大，不適宜作滅菌劑。過氧化氫其作用效果最好，對植物外植體的殺害也比較小，但其具有極強(qiáng)的毒性，使用后需回收。酒精對外植體的殺傷力大，作用時(shí)間應(yīng)該嚴(yán)格控制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精作用時(shí)間15 s，升汞作用時(shí)間8 s為最適宜的蘋果外植體消毒組合。本試驗(yàn)對莖尖不同培養(yǎng)基進(jìn)行探討，結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中大量元素減去1/3后培養(yǎng)莖尖，褐化率顯著低于MS培養(yǎng)基。通過增加培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接次數(shù)能夠明顯的降低褐化的程度，可能是增加接種次數(shù)使得殘留至培養(yǎng)基的代謝物比較少，是否這一原因還需進(jìn)一步研究。而有研究證明了培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽越低褐化程度越低，因?yàn)檫^高的無機(jī)鹽能夠促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，從而使得細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的代謝物質(zhì)增加，遇見氧氣后，氧化變褐[3]。

蘋果病毒病在全世界各地的分布較為廣泛，其危害也很嚴(yán)重，蘋果樹體受病毒侵害以后，產(chǎn)量會下降，品質(zhì)也會受到影響，因此經(jīng)濟(jì)效益也不高[4]。本試驗(yàn)采用熱處理和莖尖組培相結(jié)合的方式進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，后期通過酶聯(lián)免疫結(jié)合PCR技術(shù)對瓶苗進(jìn)行病毒檢測，結(jié)果顯示脫毒效果良好，可作為種苗繁殖。